蝦青素通過(guò)JNK和p38MAPK通路抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷

王洪權(quán)，王玉敏，趙偉麗，張俊毅，崔其福

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院：1. 神經(jīng)內(nèi)五科；2. 腫瘤內(nèi)科；3. 病理科，內(nèi)蒙古赤峰市 024005)

大量研究表明，氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)損傷在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用[1]。OS與Aβ之間形成惡性循環(huán)，促進(jìn)AD的發(fā)生[2-3]。鑒于OS在AD中的重要作用，因此，針對(duì)抗OS的治療策略對(duì)AD的發(fā)生和發(fā)展是有效的治療途徑。蝦青素(astaxanthin, ATX)為葉黃素類化合物，其主要存在于特定的海洋動(dòng)物和植物，如魚、蝦和海藻內(nèi)[4]。ATX是強(qiáng)效抗氧化劑，但是沒(méi)有β-胡蘿卜素的活性。ATX具有許多重要的生物功能[5]。最重要的是 ATX的抗氧化活性[6]。有報(bào)道顯示，ATX可以在體外抑制6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA) 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[7-8]。ATX可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、減少谷氨酸的釋放和抗凋亡來(lái)減少腦組織因缺血引起的相關(guān)損傷[9]。前人研究表明ATX可以抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷，但其機(jī)制不清楚。本研究探討素ATX是否通過(guò)MAPK通路來(lái)抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。

1材料與方法

1.1材料Astaxanthin購(gòu)自Enzo Life Sciences Int公司，MTT購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，Aβ25-35購(gòu)自GL Biochem公司，H2DCF-DA購(gòu)自Invitrogen公司，Rabbit anti-phospho-p38(Thr180/Tyr182)antibody(#9211)，Rabbit anti-p38 antibody (#9212)，Rabbit anti-phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185) antibody(#9251)和Rabbit anti-SAPK JNK antibody(#9252)購(gòu)自CST公司。

1.2維狀A(yù)β25-35的制備Aβ25-35溶于滅菌雙蒸水，貯存濃度為2 mmol/L，于37 ℃條件下孵育7 d，使其纖維化。

1.3SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL)加入100 mL/L胎牛血清培養(yǎng)。于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4MTT檢測(cè)MTT是一種四甲基偶氮哩鹽，在活細(xì)胞線粒體玻拍酸脫氫酶的作用下被還原成藍(lán)色甲攢顆粒，其形成量與活細(xì)胞數(shù)和線粒體玻拍酸脫氫酶的活性呈正相關(guān)。SH-SY5Y細(xì)胞以1×104個(gè)/孔密度接種于96孔板中，100 μL/孔。于37 ℃ 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜。12 h后，吸棄上清液。96孔板中處理好的細(xì)胞，每孔加入20 μL(5 mg/mL)MTT，37 ℃孵育4 h，并加入150 μL DMSO，振蕩8 min，待紫色結(jié)晶充分溶解后，置酶標(biāo)儀上測(cè)各孔光吸收值(A)。然后以A值求細(xì)胞存活率。

1.6Westernblot法檢測(cè)蛋白表達(dá)參照文獻(xiàn)[19]的方法。

1.7統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。資料采用GraphPad Prism 4.0 software(GraphPad Software, Inc.,San Diego, CA)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)比較用studentttest，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1蝦青素改善Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的降低我們首先檢測(cè)ATX(分子結(jié)構(gòu)式見圖1)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響。ATX(1～10 μmol/L)預(yù)處理1.5 h后，25 μmol/L Aβ25-35處理細(xì)胞24 h(表1)，Aβ25-35明顯降低細(xì)胞活力。細(xì)胞活力檢測(cè)顯示，ATX(5和10 μmol/L)預(yù)處理組可以明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的降低。

圖1 蝦青素的分子結(jié)構(gòu)圖

表1 ATX對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降的影響

藥物預(yù)處理細(xì)胞1.5 h后加入25 μmol/L Aβ25-35作用24 h；與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與Aβ25-35組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.2蝦青素改善Aβ25-35對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和死亡的機(jī)制中有氧化應(yīng)激機(jī)制的參與。用熒光探針2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇ROS的聚集。H2DCF-DA進(jìn)入細(xì)胞后能使細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物、氫過(guò)氧化物等氧化分解為二氯熒光素(Dichlorofluorescein, DCF)而產(chǎn)生熒光，其熒光強(qiáng)度與活性氧的濃度呈線性關(guān)系。25 μmol/L Aβ25-35處理的SH-SY5Y 細(xì)胞組，其熒光強(qiáng)度明顯增高，而ATX預(yù)處理可以劑量依賴性降低Aβ25-35引起的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(表2)。結(jié)果表明，ATX可以抑制或清除Aβ25-35處理誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。

表2 ATX對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

藥物預(yù)處理細(xì)胞4 h后加入25 μmol/L Aβ25-35作用24 h；與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與Aβ25-35組比較，**P<0.01。

2.3蝦青素抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的JNKs的激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)家族的激活參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡進(jìn)程。目前，已知JNKs的激活介導(dǎo)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[10]。因此，我們接下來(lái)檢測(cè)ATX對(duì)Aβ25-35引起的JNKs激活的影響。JNKs的蘇氨酸183/酪氨酸185(Thr183/Tyr185)位點(diǎn)磷酸化是其激活的主要形式。用識(shí)別Phospho-SAPK/JNKs (Thr183/Tyr185) 的特異性抗體進(jìn)行的分析顯示，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Aβ25-35作用24 h可引起JNKs(圖2)的激活，而ATX預(yù)處理可以劑量依賴性抑制Aβ25-35引起的這種激活。

2.4蝦青素抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的p38MAPK的激活目前，已知p38MAPK的激活亦介導(dǎo)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[10]。因此，我們接下來(lái)檢測(cè)ATX對(duì)Aβ25-35引起的p38MAPK的激活的影響。p38MAPK蘇氨酸180/酪氨酸182(Thr180/Tyr182)位點(diǎn)磷酸化是其激活的主要形式。用識(shí)別Phospho-p38MAPK(Thr180/Tyr182)的特異性抗體進(jìn)行的分析顯示，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Aβ25-35作用24 h可引起p38MAPK(圖3)的激活，而ATX預(yù)處理可以劑量依賴性抑制Aβ25-35引起的這種激活。

圖2 ATX對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中JNK激活的影響

圖3 ATX對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中p38MAPK激活的影響

3討論

AD是一種老年性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病率隨著人口的老齡化而迅速增長(zhǎng)。該病是老齡人口罹患癡呆最常見的原因，已成為繼心血管疾病、癌癥和中風(fēng)之后的又一嚴(yán)重危害人類健康的疾患。AD的病因目前仍不明確，因此尚無(wú)確切有效的治療方法。故探索預(yù)防和治療AD的有效措施刻不容緩，對(duì)阿爾茨海默病的治療有著重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)意義。

大量研究表明，OS損傷在AD的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用[1]。Aβ在特定腦區(qū)的聚集,介導(dǎo)OS損傷在AD的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮主要的作用[1]。Aβ可以在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)OS[11]，而OS可以增加Aβ的產(chǎn)生和聚集[2]。最近研究顯示，OS促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生和聚集，反過(guò)來(lái)Aβ又誘導(dǎo)OS，進(jìn)而增加Aβ的產(chǎn)生，如此在OS與Aβ之間形成惡性循環(huán)，促進(jìn)AD的發(fā)生[2-3]。鑒于OS在AD中的重要作用，因此，針對(duì)抗OS的治療策略對(duì)AD的發(fā)生和發(fā)展是有效的治療途徑。因此，一項(xiàng)具有廣泛前景的預(yù)防和治療AD的方法就是減弱或抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)一些天然抗氧化劑，如石杉?jí)A甲(huperzine A)[12]、姜黃(curcumin)[13]，銀杏(ginkgo biloba)[14]、丹參酮(tanshinone IIA)[15-16]、紅景天甙(salidroside)[17]和番茄紅素(lycopene)[18]和人參皂苷Rb1[20]已經(jīng)證實(shí)可以抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

ATX其主要存在于特定的海洋動(dòng)物和植物，如魚、蝦和海藻內(nèi)。ATX是強(qiáng)效抗氧化劑，具有多種藥理學(xué)作用。有報(bào)道顯示，ATX可以在體外抑制6-羥多巴胺 (6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。ATX可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、減少谷氨酸的釋放和抗凋亡來(lái)減少腦組織因缺血引起的相關(guān)損傷。同時(shí)，ATX在AD中的作用引起了研究者的關(guān)注。研究表明，ATX前人研究表明ATX可以抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷，但其機(jī)制尚不清楚。本研究表明ATX可以通過(guò)抗氧化機(jī)制抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。許多研究表明，OS參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制，ROS產(chǎn)生介導(dǎo)Aβ?lián)p傷機(jī)制。本研究表明，ATX可以抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的過(guò)度產(chǎn)生(表2)。OS是MAPK激酶激活的主要刺激因素，是MAPK激酶激活參與凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究顯示JNK和p38 MAPK的激活與細(xì)胞毒性損傷相關(guān)，Aβ可促進(jìn)二者的激活進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷的發(fā)生。本研顯示Aβ25-35激活JNK和p38 MAPK，而ATX可以劑量依賴性抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的JNK(圖2)和p38 MAPK(圖3)激活。這一結(jié)果表明，ATX通過(guò)抑制JNK和p38 MAPK激活，進(jìn)而抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

總之，我們的研究表明蝦青素可以抑制Aβ25-35引起的ROS的產(chǎn)生增加，進(jìn)而抑制JNK和p38 MAPK激活，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。在AD中具有神經(jīng)保護(hù)作用，這種保護(hù)機(jī)制與其抑制JNK和p38MAPK的激活有關(guān)。本研究為探討蝦青素作為AD的潛在預(yù)防和治療藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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