應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選克山病差異表達基因

王 斌，何淑蘭，雷艷霞，譚武紅，張 峰，王 盼，朱延河，郭 雄

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，陜西西安 710061)

克山病(Keshan disease, KD)是一種原因不明的地方性心肌病，以心肌損傷為主要特征，主要侵犯婦女與學(xué)齡前兒童，主要特點為可導(dǎo)致心源性休克與充血性心力衰竭的多灶性心肌壞死與纖維化[1]，臨床表現(xiàn)為心臟增大，心力衰竭，不同程度的急、慢性心功能不全及心率失常。調(diào)查顯示，KD病區(qū)內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境硒含量較低，病區(qū)居民處于低硒狀態(tài)，其血硒、尿硒及發(fā)硒的含量均低于非病區(qū)居民[2]。硒缺乏被公認(rèn)是KD發(fā)病的相關(guān)因素，但不是KD發(fā)病的唯一因素[3]。KD具體的分子發(fā)病機制尚不清楚，目前普遍認(rèn)為KD是環(huán)境因素(低硒、糧食真菌感染[4])與多基因共同作用的結(jié)果。基因芯片(gene chip或DNA microarray)是以基因序列為分析對象，基于核酸互補雜交原理所研制的DNA芯片[5]，具有高通量、并行性、微量化和自動化等特點，成為近些年來發(fā)展非常迅速、應(yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的生物技術(shù)之一[6]。本研究采用全基因組表達譜芯片技術(shù)，對比KD患者與病區(qū)對照者基因表達譜的變化，篩選出與KD相關(guān)的差異表達基因，并對這些基因進行功能及通路分析，進一步探討KD發(fā)病的分子機制。

1材料與方法

1.1研究對象與分組以陜西省克山病病區(qū)黃陵縣和旬邑縣為調(diào)查點，依據(jù)我國《克山病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 210-2011)，按照病例與對照年齡相近、性別相同進行1∶1配對，研究對象年齡在20～70歲之間。從43例KD患者中共選出16例KD患者，8例慢型KD[男2例，女6例，平均年齡(49.1±7.0)歲]，8例潛在型KD[男2例，女6例，平均年齡(46±9.5)歲]；從33例病區(qū)正常對照中選擇16例[男4例，女12例，平均年齡(49.7±8.3)歲]，組成16對，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗KD組與對照組年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。再按照每4例病例(慢型、潛在型各2例)為一組，每4例對照為一組，共8組。所有入選對象均經(jīng)臨床檢查、心電圖、心臟超聲、心功能檢查、X線胸部正位攝片檢查。同時排除其他心肌病及其他疾病。采集肘靜脈血5 mL，加入保護劑，-80 ℃冰箱低溫保存。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取和測定 Trizol一步法提取血樣總RNA，每組4例樣品RNA按等量混合以消除個體差異，共形成8組混合RNA樣。采用Qiagen公司的RNA純化試劑盒(RNeasy Midi Kit)進行純化收集，甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA中28S rRNA和18S rRNA比例，以檢測RNA樣品的質(zhì)量。用紫外分光光度計檢測RNA的含量和濃度。RNA合格后可用于芯片檢測。

1.2.2基因芯片雜交 采用Lifegen公司的RNA擴增與熒光標(biāo)記試劑盒，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cRNA，并進行熒光標(biāo)記，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進行。采用Agilent公司的人類全基因組表達芯片(Human 4×44K Whole Genome microarray, G4112F)進行基因芯片雜交，該芯片共包含44 290個寡聚核苷酸探針，雜交過程嚴(yán)格按照基因芯片操作說明與步驟進行?；蛐酒s交所用試劑均購自Agilent公司。采用GenePix4000B Scanner掃描基因芯片雜交圖像，采用GenePix 3.0和Spotfire 8.0軟件分析芯片雜交圖像，進行信號識別、數(shù)據(jù)分析和質(zhì)量控制。

1.2.3實時定量PCR驗證 收集6例KD患者和6例正常對照，病例和對照均來自芯片實驗樣本同一地區(qū)，采用芯片實驗相同方法提取總RNA，采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMreverse transcriptase)，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨機挑選其中3個差異表達基因HBA2、APOA1、BCL2L1進行芯片數(shù)據(jù)驗證。引物參照GenBank數(shù)據(jù)庫基因序列進行設(shè)計(表1)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用美國Bio-Rad公司的iQ5TMReal-Time PCR Systems進行實時定量PCR分析。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃/55 ℃(HBA2)30 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)。

表1 引物序列

1.3芯片數(shù)據(jù)分析SAM4.0軟件進行單基因表達分析。SAM軟件設(shè)置參數(shù)：Two class unpaired方法，Minimum Fold Change=2，同時False Discovery Rate(%)<5%的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達基因。IPA(ingenuity pathways analysis)軟件對差異表達基因進行通路和功能分析。

2結(jié)果

2.1總RNA的抽提結(jié)果樣品RNA的A260/280值均在1.79～1.99之間。由圖1可見，總RNA電泳條帶清晰，28S比18S rRNA條帶亮度接近2∶1，說明純度高，未降解，可以滿足后續(xù)實驗需要。

圖1 樣品的總RNA甲醛凝膠電泳圖譜

2.2芯片檢測結(jié)果KD患者與正常對照相比，共得出78個差異表達基因，其中表達上調(diào)的有59個(表2)，表達下調(diào)的有19個(表3)。通過查詢各基因的功能發(fā)現(xiàn)，與代謝相關(guān)的基因有14個，上調(diào)的有9個，下調(diào)的有5個；與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因有7個，上調(diào)的有5個，下調(diào)的有2個；與離子通道與運輸?shù)鞍紫嚓P(guān)的基因有6個，上調(diào)的有4個，下調(diào)的有2個；與蛋白合成與修飾相關(guān)的基因有5個，上調(diào)的有4個，下調(diào)的有1個；與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因有5個，上調(diào)的有2個，下調(diào)的有3個(表4)。

2.3實時定量PCR驗證在KD患者78條差異表達的基因中，隨機選取3個基因進行熒光定量RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，BCL2L1、APOA1表達上調(diào)，HBA2表達下調(diào)。經(jīng)比較其相對表達率，并與芯片結(jié)果進行比較，可以確認(rèn)芯片與熒光定量PCR比較基因表達差異趨勢完全符合，表明基因芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠(圖2)。

表2 KD患者差異表達上調(diào)的基因

Fold Change表示KD患者和正常對照中基因表達信號強度的比值。

表3 KD患者差異表達下調(diào)的基因

Fold Change表示KD患者和正常對照中基因表達信號強度的比值。

表4 KD患者和正常對照差異表達基因的功能分析

圖2 驗證KD患者差異表達基因

2.4IPA分析結(jié)果78例KD患者差異表達基因經(jīng)IPA功能分析，獲得5個顯著的生物功能(表5)，主要涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞功能修復(fù)、分子轉(zhuǎn)運、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和分化，其中以細(xì)胞功能修復(fù)相關(guān)的表達基因最多(26個基因)；經(jīng)IPA分析獲得主要的相關(guān)通路有9條(表6)。

表5 KD患者差異表達基因的生物功能IPA分析

表6 KD患者差異表達基因的相關(guān)主要通路IPA分析

Ratio比值表示KD相關(guān)基因在該通路所有基因中所占的比例。

3討論

本研究利用全基因組表達芯片技術(shù)，比較了KD患者和病區(qū)正常對照外周血單核淋巴細(xì)胞基因表達譜的差異，篩選出多個顯著差異表達的基因。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的差異表達基因有11個，其中，上調(diào)的10個，下調(diào)的1個；和細(xì)胞功能修復(fù)相關(guān)表達基因有26個，上調(diào)的23個，下調(diào)的3個。這些基因的表達差異可能與KD患者心肌實質(zhì)的變性、壞死及其后的吸收修復(fù)相關(guān)。實時定量PCR驗證了3個基因，結(jié)果與基因芯片表達趨勢吻合，還需要用大樣本量進一步驗證基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

在KD患者心肌病理切片中發(fā)現(xiàn)，心肌組織中可見散在的凋亡細(xì)胞[7]。另有研究顯示，細(xì)胞凋亡及Desmin結(jié)構(gòu)蛋白的異常同時出現(xiàn)于亞急型KD患者的心肌組織中[8]。這些研究表明心肌細(xì)胞凋亡在KD的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。BCL2L1是Bcl-2基因家族的一員，BCL2L1基因家族及其相關(guān)蛋白Bcl-2是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因[9]。BCL2L1是細(xì)胞凋亡調(diào)控的一個重要基因，其編碼的的蛋白位于細(xì)胞線粒體外膜，調(diào)節(jié)線粒體外膜通道(VDAC)開放，VDAC調(diào)節(jié)線粒體膜電位，從而控制活性氧的產(chǎn)生和線粒體細(xì)胞色素C的釋放。這兩種物質(zhì)都可以很強地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而使心臟陷于缺血、缺氧狀態(tài)。心臟是一個耗氧旺盛的代謝器官，在生理條件下心肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基累積的機會就明顯高于其他組織。一旦由于某些原因使心臟陷于缺血、缺氧狀態(tài)，將使心臟的氧平衡和自由基平衡遭受破壞，呼吸鏈中氧化反應(yīng)與磷酸化過程的偶聯(lián)狀態(tài)不能順利進行，造成自由基在心肌線粒體中大量堆積，直接誘發(fā)線粒體DNA的結(jié)構(gòu)和功能代謝的紊亂[10]。線粒體的紊亂又會加重心肌缺血、缺氧，使心肌細(xì)胞始終處在缺血、缺氧環(huán)境中，形成長期的惡心循環(huán)。凋亡細(xì)胞主要分布在克山病心肌組織壞死灶周圍、乳頭肌、心內(nèi)膜下心肌，血管內(nèi)皮細(xì)胞中也可見散在凋亡細(xì)胞。大量的心肌表觀學(xué)研究表明，心肌細(xì)胞凋亡在克山病的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。因此，推測BCL2L1基因的表達上調(diào)可能與KD患者心肌細(xì)胞線粒體代謝紊亂、長期處于缺血、缺氧狀態(tài)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞變性、壞死相關(guān)。

HBA2基因在KD患者中表達下調(diào)。2條α鏈(HBA)與2條β鏈(HBB)組成血紅蛋白(HBA)，成人體內(nèi)大約97%的總血紅蛋白均由HBA構(gòu)成。單個α鏈與β鏈組成HBA2，HBA2與胎兒血紅蛋白共同構(gòu)成總血紅蛋白剩余的3%。KD患者紅細(xì)胞含硒量明顯低于正常人，并且紅細(xì)胞及紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)異常[11]。硒及其化合物是一種抗氧化劑，含硒的谷朧甘膚過氧化物酶可催化脂質(zhì)氫過氧化物和過氧化氫的降解，防止其對紅細(xì)胞膜的損害，保持紅細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性。因此，推測紅細(xì)胞內(nèi)低硒可能抑制HBA2基因的表達，也可能低硒與HBA2基因的下調(diào)共同作用于KD患者的紅細(xì)胞膜，使其結(jié)構(gòu)異常。

ACTB基因編碼6種不同的肌動蛋白，是具有高度保守性蛋白質(zhì)分子之一。肌動蛋白是構(gòu)成生物體中微絲的一個單節(jié)結(jié)構(gòu)，而微絲則是細(xì)胞骨架三大組成結(jié)構(gòu)之一。肌動蛋白參與細(xì)胞運動、細(xì)胞間信息的傳遞，以及細(xì)胞形狀與連結(jié)的建立和維持等等。紅細(xì)胞膜的肌動蛋白也是紅細(xì)胞膜骨架組分之一，對維持細(xì)胞外形與穩(wěn)定紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)也具有一定的作用。楊福愉等[11]研究結(jié)果顯示，KD患者紅細(xì)胞膜肌動蛋白與膜的結(jié)合程度低于正常對照組，紅細(xì)胞膜也發(fā)生一定的異常，紅細(xì)胞膜骨架的血影收縮蛋白的聚合狀態(tài)，肌動蛋白的結(jié)合程度，膜脂“頭部”運動自由度等都與對照有明顯的差異。KD患者紅細(xì)胞的這些變化很可能與ACTB基因的下調(diào)相關(guān)。

CSNK2A1是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，表達產(chǎn)生的蛋白激酶CK2，即酪蛋白激酶Ⅱ，是一種真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以調(diào)控許多細(xì)胞進程，如細(xì)胞生存、生長、增殖及凋亡。已有研究顯示，CK2的表達下調(diào)可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[12]；p38促蛋白激酶家族與心肌細(xì)胞肥大、凋亡相關(guān)[13]。因此，推測CSNK2A1基因的表達下調(diào)可能與KD患者心肌細(xì)胞病變相關(guān)。在本次研究中CSNK2A1基因又是網(wǎng)絡(luò)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用信號通路中的下調(diào)基因。網(wǎng)絡(luò)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是包括登革病毒、丙型肝炎病毒、腸道病毒71型[14]等在內(nèi)的許多病毒進入細(xì)胞的主要途徑。研究顯示，KD的心肌損傷與腸道病毒感染及細(xì)胞凋亡有高度相關(guān)性，這種凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)可能和腸道病毒感染誘導(dǎo)有關(guān)[15]。當(dāng)腸道病毒中的嗜心肌病毒經(jīng)感染進入血液，其通過血管壁首先攻擊的是心肌細(xì)胞。因此，推測CSNK2A1基因的表達下調(diào)可能會影響網(wǎng)絡(luò)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，促使腸道病毒進入心肌細(xì)胞，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞變性、壞死。

目前，國內(nèi)外還沒有與KD相關(guān)差異表達基因的篩選研究，與KD有著相同低硒環(huán)境因素的大骨節(jié)病已有相關(guān)研究?？傊?，本研究采用全基因表達譜芯片技術(shù)，篩選出與KD相關(guān)的78個差異表達基因，這些差異存在于不同生物學(xué)過程(如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞功能修復(fù)等)中，其中BCL2L1的上調(diào)可能與凋亡、線粒體代謝紊亂、心肌長期處于缺血、缺氧狀態(tài)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞變性、壞死相關(guān)；HBA2基因和ACTB基因的的下調(diào)很可能與KD患者紅細(xì)胞及紅細(xì)胞膜的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能異常相關(guān)；CSNK2A1是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且影響網(wǎng)絡(luò)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，促使腸道病毒進入心肌細(xì)胞，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞變性、壞死。這些基因可能在KD病理機制中扮演重要作用。但由于血樣中的單核淋巴細(xì)胞的差異基因并不能完全代表KD的差異表達基因，這些基因可能與心肌病變有關(guān)，也可能與KD患者機體的全身性反應(yīng)相關(guān)，都還需要大樣本量進一步實驗驗證。

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