hGPx-1-198Leu真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及在H9C2細(xì)胞中的表達(dá)

王素琴，牛小麟，朱延河，高登峰，林 琳

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1. 第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 地方病研究所，陜西西安 710061)

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)家族是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶體之一，是生物體內(nèi)重要的活性氧族(reactive oxygen species, ROS)清除劑。在我們前期研究中，雷聰?shù)劝l(fā)現(xiàn)慢性克山病患者具有較高的GPx-1基因198位點(diǎn)的C-T多態(tài)性頻率，GPx-1-198Leu等位基因型者患克山病的風(fēng)險比GPx-1-198Pro等位基因型者增加123%，提示GPx-1基因198位點(diǎn)等位基因與克山病患病風(fēng)險之間存在關(guān)聯(lián)[1]。其他研究顯示GPx-1基因198位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等癌癥密切相關(guān)。而關(guān)于GPx-1-198Leu基因的體外研究為數(shù)不多。因此，在本研究中，我們擬通過構(gòu)建含hGPx-1基因Pro198Leu多態(tài)的真核表達(dá)載體，并觀察其對補(bǔ)充亞硒酸鈉后在大鼠心肌細(xì)胞系H9C2中的反應(yīng)性表達(dá)情況，為后續(xù)深入研究hGPx-1-198Leu基因在心血管及其他相關(guān)疾病中的作用與機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒與菌株及主要試劑pEGFP-N3質(zhì)粒、DH5α菌株和HEK293細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。H9C2細(xì)胞由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理系藏偉進(jìn)教授惠贈。BamHⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、RNAiso Plus(TaKaRa)，PCR試劑(康為世紀(jì)公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(浙江天杭)，TurboFectTM體外轉(zhuǎn)染試劑(Fermentas公司)；亞硒酸鈉(Sigma公司)；DNA Marker Ⅰ(北京天根)；卡那青霉素(西安沃爾森)、酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID公司)、瓊脂糖和瓊脂粉購于(DIFCO公司)；OMEGA無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(OMEGA公司)；引物的合成及測序均由大連寶生物公司完成。羊抗人GPx-1多克隆抗體(Santa Cruz)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記兔抗羊IgG二抗、兔抗β-actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(北京博奧森)。

1.2目的基因cDNA的合成根據(jù)GenBank上提供的人GPx-1基因序列號EC1.11.1.9，并考慮到GPx-1的翻譯需要3’UTR莖環(huán)結(jié)構(gòu)或硒代半胱氨酸插入序列(selenocystenine insertion sequence，SECIS)，采用全基因合成獲得目的基因cDNA，將198位點(diǎn)編碼脯氨酸的密碼子CCC改變?yōu)榱涟彼崦艽a子CTC,包括從起始密碼子到polyA尾信號及部分polyA尾，同時目的基因cDNA兩端分別引入酶切位點(diǎn)，5端是BamHⅠ，3端是NotⅠ。

1.3重組質(zhì)粒hGPx-1-198Leu的構(gòu)建及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切目的基因片段和pEGFP-N3質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶將酶切后的目的片段和質(zhì)粒進(jìn)行定向連接，用氯化鈣法處理制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，之后將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并涂于含卡那霉素的LB瓊脂板，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆，接種于3 mL含有卡那霉素抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)8～12 h至對數(shù)生長期，吸取1 mL上述菌液加入到4 mL含抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃劇烈震蕩培養(yǎng)2～3 h。

1.4hGPx-1-198Leu重組載體的提取和鑒定用OMEGA無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒從上述得到的菌液中提取質(zhì)粒，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR驗(yàn)證所提質(zhì)粒，以GenBank提供的人GPx-1基因198位點(diǎn)Pro/Leu(rs1050450)附近序列為模板，引物序列來自于之前的報道[2]。上游引物：5′- CGCTTCCAGACCATTGACATC-3′，下游引物：5′-CGAGGTGGTATTTTCTGTAAGATCA -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為196 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板質(zhì)粒DNA 2 μL，2XTaqMaster Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，加ddH2O 至25 μL，PCR循環(huán)反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共35個循環(huán)。并將提取的質(zhì)粒送TaKaRa公司測序分析。

1.5hGPx-1-198Leu真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞復(fù)蘇凍存的HEK293細(xì)胞，用含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。用TurboFectTM體外轉(zhuǎn)染試劑將表達(dá)載體hGPx-1-198Leu瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，命名為Leu。以空質(zhì)粒pEGFP-N3轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照和轉(zhuǎn)染效率參照，命名為Con。未轉(zhuǎn)染組命名為Non。轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，并拍照記錄。

1.6RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞GPx-1轉(zhuǎn)錄情況轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，按照RNAiso Plus試劑說明書步驟提取總RNA，溶于DEPC水中，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書配制反應(yīng)液20 μL，合成cDNA。以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，引物、PCR反應(yīng)體系和PCR循環(huán)反應(yīng)條件同質(zhì)粒鑒定時所用。將PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 min。凝膠圖像分析儀分析結(jié)果。

1.7大鼠心肌細(xì)胞系H9C2的轉(zhuǎn)染及補(bǔ)硒后GPx-1的表達(dá)在37 ℃、50 mL/L CO2的孵育箱中培養(yǎng)細(xì)胞。每隔2 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)沖洗細(xì)胞3次，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶3的比例加入含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，8 000 r/min，5 min，再用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，為了排除血清中硒的影響，用含50 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基本就屬于低硒環(huán)境)。并將細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞匯合密度達(dá)60%～70%時，用空質(zhì)粒pEGFP-N3和重組載體hGPx-1-198Leu轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，方法同前。以相同體積的PBS做為陰性對照轉(zhuǎn)染24 h后，給予0、0.03、0.09 μg/mL的亞硒酸鈉，48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，用分光光度計進(jìn)行蛋白定量，Western blot檢測各組細(xì)胞GPx-1的表達(dá)水平。以上操作均重復(fù)三次以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可靠性。提取的蛋白加入上樣緩沖液后加熱變性；制備120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠；以100 μg總蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育抗體，其中各抗體稀釋度依次為：一抗(山羊抗人GPx-1多克隆抗體(1∶100)，HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗(1∶5 000)，兔抗β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)。增強(qiáng)型發(fā)光液發(fā)光顯影、曝光。凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像，用Quantityone軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。

2結(jié)果

2.1目的基因cDNA的獲得采取人工合成的方法合成hGPx-1-198Leu基因cDNA片段全長869 bp，5′端和3′端分別引入了BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。

2.2重組質(zhì)粒PCR及測序鑒定以提取的質(zhì)粒DNA為模板，以檢測GPx-1基因198位點(diǎn)多態(tài)特異引物擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到196 bp目的條帶(圖1)。測序結(jié)果與NCBI Blast比對顯示目的基因序列正確(圖2)。

圖1 PCR鑒定hGPX-1-198Leu重組質(zhì)粒的凝膠電泳分析

圖2 hGPX-1-198Leu重組質(zhì)粒的測序鑒定

2.3hGPx-1-198Leu載體成功轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞用TurboFectTM體外轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作按說明進(jìn)行。以pEGFP-N3質(zhì)粒做為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率的參照；熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒后的HEK293細(xì)胞

2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GPx-1基因的mRNA表達(dá)水平不同轉(zhuǎn)染組GPx-1mRNA有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.647，P=0.013)。RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染重組載體后的細(xì)胞GPx-1 mRNA水平比空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(P=0.006)和未轉(zhuǎn)染組明顯增加(P=0.02)，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組之間無明顯差異(P=0.325)(圖4)。

圖4 RT-PCR檢測HEK293轉(zhuǎn)染后GPx-1mRNA表達(dá)水平(A)和GPx-1與β-actin的mRNA的比值(B)

2.5 Western blot檢測H9C2細(xì)胞中補(bǔ)硒后GPx-1蛋白表達(dá)的變化 Non：未轉(zhuǎn)染組；Con：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；Leu：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。與Non和Con組比較，*P<0.05。2.5Westernblot檢測H9C2細(xì)胞中補(bǔ)硒后GPx-1蛋白表達(dá)的變化未轉(zhuǎn)染組(Non)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Con)和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Leu)三組分別在轉(zhuǎn)染和補(bǔ)硒之后進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在未轉(zhuǎn)染、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和重組載體轉(zhuǎn)染情況下，GPx-1表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)意義(Non：F=19.72，P=0.002)；(Con：F=15.833，P=0.004)；(Leu：F=21.285，P=0.002)。與空質(zhì)粒和重組載體轉(zhuǎn)染不同的是，在未轉(zhuǎn)染組，給予0.03 μg/mL和0.09 μg/mL的亞硒酸鈉后，GPx-1表達(dá)水平無明顯差異(表1、圖5)。

表1 不同組別GPx-1表達(dá)的比較

在相同轉(zhuǎn)染條件下，與0 μg/mL組比較，*P<0.05；與0.03 μg/mL組比較，#P<0.05。

圖5 H9C2細(xì)胞在未轉(zhuǎn)染組(A)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(B)和重組載體轉(zhuǎn)染組(C)補(bǔ)硒后GPx-1的表達(dá)水平

3討論

GPx家族是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶體之一，與體內(nèi)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)一起構(gòu)成了機(jī)體的抗氧化防御體系。胞質(zhì)型谷胱甘肽過氧化物酶(cellular glutathione peroxidase)屬于GPx家族中第一個被確認(rèn)的哺乳動物含硒蛋白[3]，也是分布最廣泛的過氧化物酶，主要分布在細(xì)胞質(zhì)和線粒體。GPx-1對于清除細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，減輕細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化及保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能有著重要作用。并且，GPx-1通過限制過氧化氫生成過多，從而對生長因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、線粒體功能和正常巰基氧化平衡的維持等生理過程進(jìn)行調(diào)控[4]。研究表明，自由基異常增多與諸多疾病發(fā)病密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)GPx-1以四聚體形式存在，一個酶分子含四個硒原子，GPx-1的活力中心是硒代半胱氨酸(selenocysteine, Se-Cys)，已經(jīng)證實(shí)，硒以Se-Cys的形式插入GPx-1的活力中心發(fā)揮作用[5]，低硒可以降低GPx-1mRNA穩(wěn)定性使其降解增加[6]，并降低GPx-1含量和蛋白活性;而補(bǔ)硒又可明顯提高機(jī)體GPx-1活力[7]。近年來，大量實(shí)驗(yàn)表明，GPx-1在保護(hù)心肌、血管以及相關(guān)臟器對抗氧化應(yīng)激損傷方面有著極其重要的作用[8-9]。有學(xué)者報道，GPx-1基因的198位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)，即C-T，導(dǎo)致編碼脯氨酸CCC的密碼子由編碼亮氨酸CTC的密碼子取代。朱建宏等研究表明血GPx活性與GPx-1基因Pro198Leu多態(tài)性有關(guān)[10]。GPx-1活性是預(yù)測心血管事件的獨(dú)立因子且其與心血管事件呈負(fù)相關(guān)，即升高GPx-1酶活力可明顯降低心血管事件發(fā)生率[11]。周文銳等研究表明，上海漢族人群2型糖尿病與GPx-1基因Pro198Leu多態(tài)相關(guān)，提示GPx-1基因Pro198Leu多態(tài)性的T等位基因可能是2型糖尿病發(fā)病的風(fēng)險因子，但不是2型糖尿病發(fā)生冠心病的風(fēng)險因素[12]。然而，NEMOTO等[13]發(fā)現(xiàn)GPx-1基因的Pro198Leu多態(tài)性在2型糖尿病患者對冠脈粥樣硬化的遺傳易感性方面起關(guān)鍵作用。ZEIKOVA等[14]發(fā)現(xiàn)患有冠狀動脈疾病的男性和過早因心血管疾病而死亡的男性比正常男性具有顯著增高的T 等位基因頻率，其研究結(jié)果顯示GPx-1 Pro198Leu多態(tài)的等位基因T(Leu)使人壽命縮短，使人易患冠狀動脈性心臟病、早發(fā)的心肌梗死(50歲之前)和過早死亡(55歲之前)。還有研究發(fā)現(xiàn)GPx-1基因198位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等癌癥密切相關(guān)[15-16]。DIAMOND[17]曾將含有人GPxPro198和GPxLeu198的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，并觀察兩種不同基因型的GPx-1基因?qū)ρa(bǔ)充微量元素硒的反應(yīng)，結(jié)果顯示含Leu等位基因的GPx-1酶活性對硒反應(yīng)比含Pro等位基因的較差。

本研究以人巨細(xì)胞病毒啟動的真核表達(dá)載體pEGFP-N3為骨架，將人GPx-1-198Leu基因插入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和NotⅠ之間，經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切和純化后與經(jīng)同樣雙酶切、純化的pEGFP-N3載體以T4 DNA連接酶進(jìn)行定向連接，轉(zhuǎn)化至DH5α后，分別經(jīng)PCR及測序驗(yàn)證，結(jié)果表明成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N3-GPx-1-198Leu，命名為hGPx-1-198Leu。瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后從mRNA水平驗(yàn)證，結(jié)果顯示GPx-1可以有效表達(dá)，這又說明GPx-1-198Leu真核表達(dá)載體得到了成功構(gòu)建。同時，我們又將重組載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞系H9C2，并觀察不同硒濃度對GPx-1的誘導(dǎo)表達(dá)情況。結(jié)果顯示重組載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中GPx-1蛋白表達(dá)水平隨著硒濃度的升高而升高。這與DIAMOND等報道的不太一致，考慮這與我們給予的最高硒濃度遠(yuǎn)比其給予的較低有關(guān)。因此，未能達(dá)到GPx-1-198Leu蛋白表達(dá)至飽和狀態(tài)所需硒濃度?？傊?，GPx-1-198Leu真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建為我們進(jìn)一步研究該基因在心血管疾病及其他氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LEI C, NIU XL, WEI J, et al. Interaction of glutathione peroxidase-1 and selenium in endemic dilated cardiomyopathy[J]. Clin Chim Acta, 2009, 399(1-2):102-108.

[2] YANG P, BAMLET WR, EBBERT JO, et al. Glutathione pathway genes and lung cancer risk in young and old populations[J]. Carcinogenesis, 2004, 25(10):1935-1944.

[3] ROTRUCK JT, POPE AL, GANTHER HE, et al. Selenium: Biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J]. Science, 1973(179):588-590.

[4] LUBOS E, LOSCALZO J, HANDY DE. Glutathione peroxidase-1 in health and disease: From molecular mechanisms to therapeutic opportunities[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 15(7):1957-1997.

[5] TOSATTO SC, BOSELLO V, FOGOLARI F, et al. The catalytic site of glutathione peroxidases[J]. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(9):1515-1526.

[6] MAQUAT LE. Evidence that selenium deficiency results in the cytoplasmic decay of GPx1 mRNA dependent on pre-mRNA splicing proteins bound to the mRNA exon-exon junction[J]. Biofactors, 2001, 14(1-4):37-42.

[7] SINCI V, GUNAYDIN S, KALAYCIOGLUS, et al. Effects of selenium enriched reperfusion solutions on isolated guinea pig hearts[J]. Keio J Med, 1998, 47(4):219-222.

[8] TORZEWSK M, OCHSENHIRT V, KlLESCHYOV AL, et al. Deficiency of glutathione peroxidase-1 accelerates the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007, 27(4):850-857.

[9] ARDANAZ N, YANG XP, CIFUENTES ME, et al. Lack of glutathione peroxidase-1 accelerates cardiac-specific hypertrophy and dysfunction in angiotensin II hypertension[J]. Hypertension, 2010, 55(1):116-123.

[10] 朱建宏，雷聰，安哲，等.血硒、GPX酶活力與GPx-1基因Pro198Leu多態(tài)關(guān)聯(lián)分析[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(6):16-18.

[11] BLANKENBERG S, RUPPRECHT HJ, BICKEL C, et al. Glutathione peroxidase-1 activity and cardiovascular events in patients with coronary artery disease[J]. N Engl J Med, 2003, 349(17):1605-1613.

[12] 周文銳，劉麗梅，鄭泰山，等.GPx-1基因Pro198Leu多態(tài)與2型糖尿病及合并冠心病的關(guān)系[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007, 27(7):770-773.

[13] NEMOTO M, NISHIMURA R, SASAKI T, et al. Genetic association of glutathione peroxidase-1 with coronary artery calcification in type2 diabetes: a case control study with multi-slice computed tomography[J]. Cardiovasc Diabetol, 2007, 6:23.

[14] ZEIKOVA TV, GOLUBENKO MV, BUIKIN SV, et al. The glutathione peroxidase-1(GPX1)single nucleotide polymorphism pro198Leu: association with life span and coronary artery disease[J]. Mol Biol (Mosk), 2012, 46(3):481-486.

[15] 顧杰鋒，郭建波，季朝能，等. GPX1的198位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌和乳腺癌易感性的關(guān)系[J].中國腫瘤，2009, 18(10):823-826.

[16] CHEN J, CAO Q, QIN C, et al. GPx-1 polymorphism (rs1050450) contributes to tumor susceptibility: evidence from meta-analysis[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2011, 137(10):1553-1561.

[17] HU YJ, DIAMOND AM. Role of glutathione peroxidase-1 in breast cancer: loss of heterozygosity and allelic differences in the response to selenium[J]. Cancer Res, 2003, 63(12):3347-3351.