紫云英根瘤中共生固氮下調(diào)表達(dá)基因的分離與初步分析

李一星，吳梅，李友國

摘要：對前期利用抑制消減雜交技術(shù)（Suppressive subtractive hybridization， SSH）構(gòu)建的紫云英（Astragalus sinicus）根部組織的共生固氮差異表達(dá)cDNA文庫進(jìn)行了全文庫測序和初步分析，并利用半定量RT-PCR方法驗(yàn)證了其中5個(gè)基因片段在根瘤中的下調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明，從180個(gè)克隆中共獲得94個(gè)有效序列，文庫插入片段長度為200～1 300 bp。BLAST同源比對分析結(jié)果表明，有90個(gè)序列可以找到同源片段，有4個(gè)可能為新基因，按功能分為10個(gè)類群。

關(guān)鍵詞：紫云英（Astragalus sinicus）；共生固氮；抑制消減雜交；下調(diào)表達(dá)基因

中圖分類號(hào)：S541+.3；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1684-06

Isolation and Analysis of Down-regulated Symbiotic Nitrogen Fixation Genes in Astragalus sinicus Root Nodules

LI Yi-xing， WU Mei， LI You-guo

（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： In previous work， a cDNA library of Astragalus sinicus genes related with symbiotic nitrogen fixation was constructed with suppressive subtractive hybridization（SSH）. The library containing down-regulated genes was sequenced and analyzed. Among the sequenced genes， five fragments were sckeened and its down-regulated expressions were confirmed by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that 94 genes were obtained from 180 clones and the average length of inserted fragments was 200～1 300 bp. Nucleotide BLAST homological analysis showed that 90 genes had similarities to known genes and 4 genes were putatively novel genes. All the 94 genes were divided into 10 functional categories.

Key words：Astragalus sinicus； symbiotic nitrogen fixation； suppressive subtractive hybridization； down-regulated gene

根瘤菌和豆科植物可以共生固氮，共生固氮是一個(gè)二者相互識(shí)別、相互作用的復(fù)雜過程。根瘤的形成以及根瘤菌的入侵、分化和發(fā)育離不開植物基因的參與和調(diào)控[1]。這種調(diào)控涉及多種代謝途徑和信號(hào)傳遞過程，有多個(gè)基因參與。對共生固氮過程中基因表達(dá)情況進(jìn)行全局性的研究，可以發(fā)現(xiàn)并鑒定出更多與根瘤形成和固氮過程相關(guān)的基因，有助于建立共生固氮的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如研究者從蒺藜苜蓿中鑒定出756個(gè)與根瘤形成和固氮相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中313個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，而443個(gè)基因則下調(diào)表達(dá)[2]。Lohar等[3]也從苜蓿中檢測出在根瘤菌感染的1～72 h內(nèi)各階段上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因。抑制消減雜交技術(shù)是一種以mRNA差異顯示為基礎(chǔ)的篩選差異表達(dá)基因技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于植物差異表達(dá)基因的研究。Fan等[4]利用抑制消減雜交技術(shù)篩選出火龍果中與干旱脅迫相關(guān)的基因；Guo等[5]采用抑制消減雜交從胡椒中鑒定出73個(gè)在低溫脅迫下可能受脫落酸調(diào)控的基因；韓明鵬等[6]構(gòu)建了紫花苜蓿高溫脅迫條件下的抑制消減雜交文庫，用來篩選高溫誘導(dǎo)表達(dá)的基因。抑制消減雜交技術(shù)同樣是研究共生條件下差異表達(dá)基因的有效手段。Clement等[7]構(gòu)建了干旱條件下大豆根瘤的抑制消減雜交文庫，并從中鑒定出一批與干旱條件下根瘤的固氮功能相關(guān)的新基因。Godiard等[8]通過抑制消減雜交技術(shù)篩選出52個(gè)在根瘤菌-苜蓿共生固氮過程中起調(diào)控作用的基因。

紫云英（Astragalus sinicus）是一種主要分布于中國、日本和韓國等東南亞國家的豆科綠肥。它和華癸中慢生根瘤菌共生，形成不定型根瘤，二者的共生具有嚴(yán)格的宿主專一性，是研究共生固氮的好材料[9]。前期工作中Chou等[10]構(gòu)建了紫云英根瘤的正向和反向抑制消減雜交文庫，并通過上調(diào)文庫鑒定出16個(gè)共生條件下增強(qiáng)或誘導(dǎo)表達(dá)的新基因。相對于上調(diào)表達(dá)基因，下調(diào)表達(dá)基因同等重要，本研究對前期構(gòu)建的下調(diào)文庫進(jìn)行了全文庫測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行了同源比對分析，為后續(xù)基因功能的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

華癸中慢生根瘤菌7653R（Mesorhizobium huakuii 7653R）為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室固氮室保存。RNA抽提所用Trizol試劑購自Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶、DNaseⅠ、Reverse Transcriptase M-MLV均購自Takara大連有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)及結(jié)瘤 將紫云英種子用70%乙醇處理5 min，再用3%NaClO處理10 min，然后用無菌水洗滌5～6次，將消毒后的種子用無菌水浸泡2 h后，平攤于含有0.5%蔗糖和1.2%瓊脂的平皿上，置于光照培養(yǎng)箱中22 ℃培養(yǎng)。待胚根長至1 cm左右時(shí)，將種子接種于無菌沙缽中培養(yǎng)，子葉展開后接種華癸中慢生根瘤菌7653R。所有植株均用無氮營養(yǎng)液澆灌。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA合成 接種根瘤菌7653R后26 d，收集根瘤、去除根瘤的根和未接種植株的根，用Trizol試劑提取根瘤組織總RNA，經(jīng)DNaseⅠ處理后，用紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度，然后用DEPC水將各樣品RNA濃度調(diào)整到一致。取3 μL總RNA，以O(shè)ligo dT18為引物，反轉(zhuǎn)錄酶Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以5′-ATGCAGATCTTTTGTGAAGAC-3′和5′-ACCACCACGGAAGACGGAG-3′為引物， 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增保守基因泛素序列，以驗(yàn)證cDNA合成是否有效。

1.2.3 半定量RT-PCR 分別以根瘤、去除根瘤的根和未接種植株的根的cDNA為模板，用基因特異性引物擴(kuò)增AsG6、AsC2、AsB3、AsT6、AsD5這5個(gè)基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行半定量分析，以232 bp的18S rRNA 基因片段為內(nèi)參。所用引物序列見表1。

1.2.4 序列分析 目的基因氨基酸序列推測及比對利用BioEdit軟件進(jìn)行。同源比對利用BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http：//ca.expasy.org/）進(jìn)行。氨基酸保守結(jié)構(gòu)域采用InterProScan （http：//www.ebi.ac.uk/）和Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 文庫序列的聚類分析

將下調(diào)文庫進(jìn)行全文庫測序，共獲得94個(gè)有效序列，插入片段的大小在200～1 300 bp。將所有序列利用BLAST程序進(jìn)行同源序列比對（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)有90個(gè)序列可以找到同源片段，同時(shí)有4個(gè)序列在數(shù)據(jù)庫中找不到同源片段，推測這4個(gè)序列可能代表新的基因。以上94個(gè)有效序列對應(yīng)81個(gè)基因，按其編碼蛋白的功能分為10個(gè)類群（圖1）：核糖體蛋白9個(gè)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白7個(gè)，基因表達(dá)相關(guān)蛋白12個(gè)，代謝相關(guān)蛋白20個(gè)，膜及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白11個(gè)，細(xì)胞應(yīng)激防御相關(guān)蛋白8個(gè)，未知蛋白6個(gè)，假定蛋白3個(gè)，無同源性蛋白4個(gè)和1個(gè)其他蛋白。

2.2 半定量RT-PCR驗(yàn)證

在測序得到的94個(gè)基因片段中，分別選取過氧化物酶、熱激蛋白、C3HC4型鋅指蛋白、假定蛋白和質(zhì)體藍(lán)素蛋白5個(gè)基因片段AsG6、AsC2、AsB3、AsT6、AsD5（表2）對其下調(diào)表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。提取接種后26 d的紫云英根瘤、感染根和未接種對照根的總RNA，進(jìn)行半定量RT-PCR分析。以232 bp的18S rRNA 基因片段為內(nèi)參，檢測5個(gè)目標(biāo)基因的半定量結(jié)果。由圖2可知，與未接種的根相比，這5個(gè)基因在根瘤中的表達(dá)量大大降低，呈明顯的下調(diào)表達(dá)特征，這說明文庫的結(jié)果是可靠的。

3 結(jié)論與討論

3.1 基因表達(dá)相關(guān)蛋白

El Yahyaoui等[2]在蒺藜苜蓿根瘤中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和11個(gè)下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，基因芯片結(jié)果顯示，其中一些轉(zhuǎn)錄因子可能與結(jié)瘤素基因的表達(dá)相關(guān)，在下調(diào)基因中包括一個(gè)與DNA結(jié)合的WRKY蛋白。Lohar等[3]對苜蓿早期共生階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了許多WRKY家族基因的下調(diào)表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)一個(gè)WRKY家族基因AsF6的下調(diào)表達(dá)。WRKY家族基因在植物抵抗病原菌侵染和其他非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其靶蛋白可能是病程相關(guān)蛋白，因此WRKY與防御相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)[11]。除WRKY外，本研究還發(fā)現(xiàn)了1個(gè)NAC家族基因AsI1的下調(diào)表達(dá)。NAC家族是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，在植物抵抗不同的生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12]，如NAC家族成員參與植物對干旱、低溫、鹽等脅迫的反應(yīng)[13]，在植物應(yīng)對病原菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮作用[14]。另外，一些NAC家族成員在植物發(fā)育的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如種子萌發(fā)[15]、細(xì)胞分裂[16]、葉的衰老[17]等。

近年來，對苜蓿MtNAC969研究發(fā)現(xiàn)，其在根應(yīng)對鹽脅迫的過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，而在苜蓿與根瘤菌的共生過程中可以刺激側(cè)根的形成，但不影響根瘤數(shù)量，同時(shí)在根瘤中的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致根瘤提前衰老[18]。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的NAC蛋白在共生過程中可能也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，值得深入研究。

3.2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因

目前發(fā)現(xiàn)在根瘤菌和宿主共生的過程中，植物中有很多信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因是上調(diào)表達(dá)的。同時(shí)，El Yahyaoui等[2]發(fā)現(xiàn)在苜蓿中有些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因是下調(diào)表達(dá)的，如鈣調(diào)素-GTP結(jié)合蛋白、鋅指蛋白、蛋白激酶以及與CLAVATA1、Lj HAR 和GmNARK同源的受體激酶，可能與結(jié)瘤的自主調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)了許多紫云英根瘤中下調(diào)表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，包括編碼磷酸誘導(dǎo)蛋白1、鈣調(diào)蛋白4、泛素家族蛋白、蛋白磷酸酶、蛋白激酶等的基因。

膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白在類菌體與植物細(xì)胞物質(zhì)交換的過程中發(fā)揮重要作用，根瘤的固氮會(huì)增加根瘤和根部的氨基酸、己糖、硫酸鹽等的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)有一些轉(zhuǎn)運(yùn)基因被下調(diào)表達(dá)，如某些磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在苜蓿的根瘤中下調(diào)表達(dá)[19]。本研究中下調(diào)的相關(guān)基因有11個(gè)（膜及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白對應(yīng)基因），編碼蛋白包括硫氧還蛋白h、細(xì)胞溶質(zhì)因子、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體、鈉鈣交換體蛋白、液泡儲(chǔ)藏蛋白55家族蛋白等。

3.3 代謝相關(guān)蛋白

在下調(diào)表達(dá)的基因中，初級(jí)和次級(jí)代謝相關(guān)基因較多，包括UDP-葡糖醛酸酯-4-異構(gòu)酶、分支酸合成酶、SAM依賴的羧甲基轉(zhuǎn)移酶、長鏈脂肪酸-輔酶A連接酶家族蛋白、S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶、NAD依賴型異檸檬酸脫氫酶、質(zhì)體藍(lán)素、12-氧代植二烯酸-10，11-還原酶等22個(gè)基因。El Yahyaoui等[2]也研究發(fā)現(xiàn)與根中相比，大量與初級(jí)和次級(jí)代謝相關(guān)的基因在苜蓿根瘤中被下調(diào)表達(dá)。這可能反映了根瘤與根在代謝水平上的差異，如在根瘤中很多代謝途徑受到了抑制，另一些與固氮相關(guān)的代謝途徑卻被激活。

3.4 防御和應(yīng)激相關(guān)基因

一般認(rèn)為，根瘤菌與植物共生的過程中需要抑制宿主的防御機(jī)制，從而保證其成功入侵[20]。事實(shí)上，確實(shí)有很多與病程和防御相關(guān)的基因表達(dá)在共生過程中受到抑制，如在苜蓿中編碼過氧化物酶、多數(shù)非特異性轉(zhuǎn)脂蛋白、脂肪氧化酶、PR10/Betv1、Kunitz 型胰蛋白酶抑制劑等的基因均被下調(diào)表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn)1個(gè)過氧化物酶編碼基因AsG6的下調(diào)表達(dá)，除此之外下調(diào)的基因還包括脂肪酸酰基輔酶A脫氫酶、生存蛋白、過氧化物酶、熱激蛋白Hsp70、鐵氧化還蛋白、dnaJ伴侶蛋白等。豆科植物通過抑制防御基因的表達(dá)允許根瘤菌的侵入，然而某些防御和抗病相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)又說明豆科植物同時(shí)還要限制根瘤菌的侵入，或保護(hù)根瘤不受病原菌和昆蟲的侵害[21]。

3.5 未知基因、假設(shè)蛋白基因和無同源性基因

在下調(diào)基因中，未知蛋白編碼基因有6個(gè)，假定蛋白基因有3個(gè)，無任何同源性的基因有4個(gè)，這些基因都有可能是一些尚未被發(fā)現(xiàn)的新基因，特別是無任何同源性的4個(gè)基因，有待進(jìn)一步研究。

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