新疆維漢彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中Bcl-6 c-myc基因易位的差異性研究*

趙 兵 李 迅 劉 煒 李 妍 趙振慧 楊順娥

新疆維漢彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中Bcl-6 c-myc基因易位的差異性研究*

趙 兵 李 迅 劉 煒 李 妍 趙振慧 楊順娥

目的：探討新疆維吾爾族、漢族彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）患者Bcl-6、c-myc基因易位的差異及其臨床意義。方法：采用熒光免疫原位雜交（FISH）方法，對233例DLBCL活體石蠟切片進(jìn)行Bcl-6、c-myc基因檢測。觀察Bcl-6、c-myc基因易位與DLBCL患者臨床資料的關(guān)系，并對不同民族在不同亞型DLBCL中Bcl-6、c-myc基因易位的情況進(jìn)行比較。結(jié)果：233例DLBCL中，Bcl-6基因重排51例，占21.89%；c-myc基因重排39例，占16.74%；Bcl-6基因易位的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)病部位、臨床分期和LDH水平無顯著相關(guān)（P＞0.05），而與民族、IPI評分、結(jié)外侵犯、B癥狀、DLBCL不同亞型和近期療效有相關(guān)性（P＜0.05）；c-myc基因易位的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)病部位、臨床分期、LDH水平和DLBCL不同亞型無明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與民族、IPI評分、結(jié)外侵犯、B癥狀和近期療效有相關(guān)性（P＜0.05）；維、漢不同民族GCB中Bcl-6、c-myc基因易位比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；維、漢不同民族非生發(fā)中心活化B細(xì)胞（non-GCB）中Bcl-6、c-myc基因易位比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：Bcl-6，C-myc基因易位的表達(dá)與維、漢不同民族、IPI評分、結(jié)外侵犯、B癥狀和近期療效有相關(guān)性；維、漢民族non-GCB亞組中Bcl-6、c-myc基因易位存在差異。

Bcl-6基因 c-myc基因 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin's lymphoma，NHL）最常見的類型，是在細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、臨床表現(xiàn)、對標(biāo)準(zhǔn)治療反應(yīng)及預(yù)后等方面存在明顯異質(zhì)性的疾病。2008年WHO造血和淋巴組織分類將DLBCL按臨床、形態(tài)學(xué)特征、分子生物學(xué)和免疫表型分成不同的亞種［1］。有研究［2-3］應(yīng)用cDNA微陣列技術(shù)對DLBCL進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，將DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞（germinal center B cell origin，GCB）型和非生發(fā)中心（活化）B細(xì)胞（non-germinal center B cell origin，non-GCB）型。GCB和non-GCB型具有不同的遺傳印記和不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生途徑。約50%的DLBCL病例有染色體易位，其中比較常見的基因是Bcl-6、Bcl-2、c-myc等［4］。對于DLBCL免疫分型的研究，國內(nèi)外已有較多報道，但有關(guān)維、漢兩民族的對照研究鮮見。本研究通過熒光免疫原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）對新疆維、漢兩民族DLBCL患者石蠟組織標(biāo)本進(jìn)行Bcl-6、c-myc基因易位情況進(jìn)行檢測，同時給予類CHOP方案化療，觀察其療效，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床病例 收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2007年1月1日至2013年12月31日收治的經(jīng)病理［按世界衛(wèi)生組織（WHO）新分類（2008年）］及免疫組織化學(xué)確診的DLBCL維、漢患者共233例。其中漢族142例，維吾爾族91例；男性136例，女性97例，男女比例1.40∶1；年齡最小的16歲，最大的81歲，中位年齡49歲。臨床分期按Ann Arbor分期：Ⅰ～Ⅱ期124例，Ⅲ～Ⅳ期109例。有B癥狀者76例，無B癥狀者157例。原發(fā)于結(jié)內(nèi)的154例，結(jié)外的79例。所有患者均采用類CHOP方案化療。

1.1.2 試劑及儀器 Bcl-6、c-myc探針及探針緩沖液均購自北京金蓓嘉醫(yī)療科技有限公司，所用高分辨熒光顯微鏡為日本Olympus BX51。

1.2 方法

所有標(biāo)本均為中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，由本院2名以上高年資病理學(xué)醫(yī)師對全部HE染色切片重新閱讀。免疫組織化學(xué)染色法采用Envision試劑盒（DAKO）。

采用FISH檢測Bcl-6、c-myc基因。用Olympus BX51型熒光顯微鏡在DAPI/FITC/RHOD濾光片的激發(fā)下觀察間期細(xì)胞，使用IMSTAR軟件進(jìn)行分析觀察結(jié)果。

1.3 結(jié)果判斷

Bcl-6雙色斷裂分離探針是在Bc1-6基因的5'端和3'端分別設(shè)計2個探針，分別標(biāo)以橘紅色和綠色熒光素，未發(fā)生Bcl-6基因重排的細(xì)胞顯示有2個橘紅色和綠色的融合信號（即2個黃色信號），代表1對Bcl-6等位基因；發(fā)生Bcl-6基因重排的細(xì)胞則顯示有1個橘紅色和1個綠色的融合信號，另外1個綠色和橘紅色的分離信號。c-myc雙色斷裂分離探針和Bcl-6探針類似，未發(fā)生c-myc基因重排的細(xì)胞顯示有2個橘紅色和綠色的融合信號（即2個黃色信號），發(fā)生c-myc基因重排的細(xì)胞則顯示有1個橘紅色和1個綠色的融合信號，另外1個綠色和橘紅色的分離信號。當(dāng)多于20%的腫瘤細(xì)胞核呈現(xiàn)橘紅色和綠色熒光信號分開時，即確定有Bcl-6基因或c-myc基因的重排；如果在1個細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)3個或3個以上的融合信號或3個以上的單色信號，則可以診斷為存在Bcl-6基因或c-myc基因的擴增（圖1，2）。

圖1 Bcl-6基因重排（FISH×400）Figure 1 Bcl-6 translocation（by FISH，original magnification×400）

圖2 c-myc基因重排（FISH×400）Figure 2 c-myc translocation（by FISH，original magnification×400）

1.4 療效評價

參照Recist實體瘤客觀療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD），無進(jìn)展生存時間（PFS）指從治療開始至疾病進(jìn)展的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，采用χ2檢驗行差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-6、c-myc基因易位與臨床因素的關(guān)系

Bcl-6基因易位的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)病部位、臨床分期和LDH水平無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與民族、IPI評分、結(jié)外侵犯、B癥狀、DLBCL不同亞型和近期療效有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；c-myc基因易位的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)病部位、臨床分期、LDH水平和DLBCL不同亞型無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與民族、IPI評分、結(jié)外侵犯、B癥狀和近期療效有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 維、漢兩民族GCB中Bcl-6、c-myc基因易位的比較

維、漢兩民族GCB中Bcl-6、c-myc基因易位比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.3 維、漢兩民族non-GCB中Bcl-6、c-myc基因易位的比較

維、漢兩民族non-GCB中Bcl-6、c-myc基因易位比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表1 Bcl-6，c-myc基因表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系Table 1 Relationship of Bcl-6 and c-myc gene translocation with clinical factors

表2 維、漢GCB患者中Bcl-6、c-myc表達(dá)的差異Table 2 Comparison of Bcl-6 and c-myc gene translation between Uygur and Han nationalities in the GCB subgroup

表3 維、漢n-GCB患者中Bcl-6、c-myc基因表達(dá)的差異Table 3 Comparison of Bcl-6 and c-myc gene translocation between Uygur and Han nationalities in the non-GCB subgroup

3 討論

Bcl-6第一個內(nèi)含子的397位及423～443 bp區(qū)域突變是引起B(yǎng)cl-6過度表達(dá)的原因，也是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的特異性標(biāo)志，與無該區(qū)突變的患者相比，這類病例總體生存率較低，由此證實突變區(qū)引起的Bcl-6的異常表達(dá)在淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色［5］。Bcl-6基因易位在DLBCL中發(fā)生率最高，其發(fā)生率為30%～35%［6］。本研究中，全組Bcl-6基因易位發(fā)生率為21.9%，其中漢族為15.49%，明顯低于國外研究報道；維吾爾族為31.87%，與國外研究結(jié)果相似。Bcl-6基因易位常發(fā)生于結(jié)外病變的淋巴瘤和non-GCB型［7］，本研究結(jié)外病變Bcl-6基因易位發(fā)生率25.69%，在不同的亞型中，Bcl-6基因易位發(fā)生率也顯示non-GCB高于GCB組（P＜0.05），這與國外報道一致。Bcl-6基因易位對預(yù)后判斷有重要意義［7］，本組研究結(jié)果顯示，不同IPI評分組Bcl-6基因易位發(fā)生率不同，高中危組和高危組（49.35%）的發(fā)生率高于低危組和低中危組（8.33%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示Bcl-6基因易位可能是DLBCL評價預(yù)后的一個獨立預(yù)測指標(biāo)。在以往的研究中Bcl-6基因易位與類CHOP治療療效有關(guān)［8］。在本研究中，Bcl-6基因易位與使用類CHOP方案化療有關(guān)，治療無效組Bcl-6基因易位發(fā)生率更高（P＜0.05）。

c-myc基因是myc基因家族的重要成員之一，是鳥類髓細(xì)胞增生癥病毒MC29轉(zhuǎn)化基因的細(xì)胞類似物，屬核內(nèi)癌基因，位于8q24，編碼一種短半衰期的核磷蛋白（p62c-myc），其正常表達(dá)為細(xì)胞完成周期進(jìn)程所必需。在正常細(xì)胞增殖中c-myc基因的表達(dá)水平受到嚴(yán)格的控制，其產(chǎn)物有直接調(diào)節(jié)DNA合成的作用，參與細(xì)胞分裂、分化及凋亡的調(diào)節(jié)［9］。國外研究顯示，在高度侵襲性Burkitt淋巴瘤中幾乎100%存在c-myc基因易位，而在DLBCL中c-myc基因易位檢出率為3%～16%［10-11］。本研究中，全組c-myc基因易位發(fā)生率為16.74%，其中漢族為9.15%，維吾爾族28.57%，明顯高于國外研究水平，尤其是在維吾爾族non-GCB組，其發(fā)生率更高，為32.39%，考慮新疆維吾爾族DLBCL可能存在與漢族不同的分子遺傳學(xué)特點。在DLBCL中，c-myc基因易位提示腫瘤的預(yù)后差［12］，采用類CHOP方案治療時，存在c-myc基因易位者5年生存率為44%，而無c-myc基因易位時5年生存率為67%，同時c-myc基因易位也提示腫瘤的高增殖狀態(tài)，說明新疆維吾爾族DLBCL與漢族相比腫瘤生長速度更快，需要更加強烈的化療方案進(jìn)行治療。由于本組病例數(shù)偏小，病例選擇帶來的偏差也不能完全排除，因此，需要今后進(jìn)行更加深入廣泛的研究加以證實。Niitsu等［15］進(jìn)行c-myc基因易位檢測后發(fā)現(xiàn)，c-myc基因易位與體能狀態(tài)，骨髓侵犯，高IPI及乳酸脫氫酶水平增高密切相關(guān)。本組病例顯示c-myc基因易位主要見于non-GCB型（33例，18.13%），c-myc基因易位與不同民族、IPI評分、結(jié)外侵犯、B癥狀和近期療效有相關(guān)性（P＜0.05）。這些特征與國外報道基本一致。

既往的研究結(jié)果已經(jīng)證實，不同亞型的DLBCL，其5年生存率分別為70%和12%，GCB亞型的預(yù)后明顯好于non-GCB亞型，提示Bcl-6、c-myc基因易位是non-GCB亞型預(yù)后差的預(yù)測指標(biāo)［7，12］，本研究顯示，在不同民族、不同亞型的DLBCL中，Bcl-6、c-myc基因易位存在差異。在non-GCB亞型中，維、漢不同民族患者Bcl-6、c-myc基因易位均存在差異（P＜0.05），提示在新疆特定的少數(shù)民族地區(qū)，維吾爾族、漢族DLBCL患者Bcl-6、c-myc基因易位存在各自的特點，有其特殊的研究價值，這為今后探討不同民族DLBCL的預(yù)防和個體化治療奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

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（2014-08-04收稿）

（2014-09-03修回）

（本文編輯：鄭莉）

Difference of Bcl-6 and c-myc gene translocation between Xinjiang Uygur and Han diffused large B-cell lymphoma subtypes

Bing ZHAO,Xun LI,Wei LIU,Yan LI,Zhenhui ZHAO,Shun'e YANG

Shun'e YANG;E-mail:yangshune@medmail.com.cn
Department of Lymphoma and Breast Cancer,Xinjiang Tumor Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China. This study was supported by Xinjiang UygurAutonomous Region Science and Technology Project(No.201191156).

Objective:To investigate the clinical significance of Bcl-6,c-myc gene abnormalities in Xinjiang Uygur and Han diffused large B-cell lymphoma(DLBCL)subtypes.Methods:Bcl-6,c-myc gene was detected by fluorescence in situ hybridization in 233 patients with DLBCL.A relationship was observed among Bcl-6,c-myc gene translocation,and clinical data in DLBCL patients. In addition,a difference was observed among Bcl-6,c-myc gene translocation,and different ethnic groups in different subtypes of DLBCL.Results:Among the 233 patients,51 cases(21.89%)had rearranged Bcl 6 gene,and 39 cases(16.74%)had rearranged c-myc gene. Bcl-6 gene translocation and expression was related with age,gender,disease location,clinical stage,and LDH levels(P＞0.05),but was not related with nationality,international prognostic index score,extranodal involvement,B symptoms,DLBCL subtypes,and recent efficacy(P＜0.05);c-myc gene translocation and expression was related with age,gender,disease location,clinical stage LDH levels, and DLBCL subtypes(P＞0.05),but was not related with nationality,IPI score,extranodal involvement,B symptoms,and recent efficacy(P＜0.05).In the Uygur and Han GCB groups,Bcl-6,c-myc gene translocation showed no significant difference(P＞0.05).By contrast,in the Uygur and Han non-GCB groups,Bcl-6,c-myc gene translocation showed significant difference(P＞0.05).Conclusion:Bcl-6,C-myc gene translocation was related with age,gender,disease location,clinical stage,and LDH levels.Bcl-6 gene translocation was also correlated with different subtypes of DLBCL.

Bcl-6 gene,c-myc gene,diffuse large B-cell lymphoma

10.3969/j.issn.1000-8179.20141310

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院淋巴瘤與乳腺癌內(nèi)科（烏魯木齊市830011）

*本文課題受新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目（編號：201191156）資助

楊順娥 yangshune@medmail.com.cn

趙兵 專業(yè)方向為淋巴瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

E-mail：doctorcrystal@163.com