余甘子果實(shí)多酚氧化酶活性影響因素研究

鄭麗平，丘春秀（等）

摘要：多酚氧化酶（PPO）是酶促褐變的關(guān)鍵酶，以余甘子（Phyllanthus emblica）果實(shí)PPO為研究對象，采用分光光度法研究余甘子果實(shí)PPO作用的最適底物，同時探究反應(yīng)體系pH、反應(yīng)溫度、底物濃度、抑制劑對余甘子果實(shí)中PPO活性的影響。結(jié)果表明，余甘子果實(shí)PPO作用的最佳底物為焦性沒食子酸，最適pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為10 ℃，底物最佳濃度為0.14 mol/L，抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸4種抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中抗壞血酸對余甘子果實(shí)PPO活性抑制效果最好。

關(guān)鍵詞：余甘子（Phyllanthus emblica）；多酚氧化酶（PPO）；活性；抑制劑

中圖分類號：R284.1；Q946.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1621-04

Factors Affecting Activities of Polyphenol Oxidase in Phyllanthus emblica

ZHENG Li-ping，QIU Chun-xiu，CHEN Xiao-hong，WANG Hui-min，ZHANG Fu-ping

（Department of Biology， Hanshan Normal University， Chaozhou 521041， Guangdong，China）

Abstract： Polyphenol oxidase（PPO） was the key enzyme of enzymatic browning. The optimal substrate to PPO of Phyllanthus emblica and effects of pH，temperature，concentration of substrate and inhibitor on PPO activity were studied with spectrophotometry. The results showed that the optimal substrate was pyrogallic acid. The optimal pH， temperature and concentration of substrate were 6.0， 10 ℃ and 0.14 mol/L， respectively. Vitamin C， citric acid， Na2SO3 and L-Cysteine had inhibition effects on PPO activity in different degree. Vitamin C had the best inhibition effect on PPO activity in the fruit of phyllanthus emblica.

Key words： Phyllanthus emblica； polyphenol oxidase（PPO）； activity； inhibitor

余甘子（Phyllanthus emblica）屬大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬植物，其果鮮食酸甜酥脆而微澀，初食味酸澀，良久乃甘，故名“余甘子”。余甘子樹耐旱耐瘠，適應(yīng)性強(qiáng)，喜光喜溫，一般樹高1～3 m，單果重15 g左右。研究表明，余甘子果實(shí)中含有豐富的超氧化物歧化酶、維生素C、多酚類物質(zhì)及多糖等活性物質(zhì)[1]。余甘子果實(shí)味酸微澀，清熱涼血，消食健脾，生津止渴。主治血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干及維生素C缺乏癥。在藏藥中，余甘子主治培根病、赤巴病、血病、高血壓病等[2]。近年研究結(jié)果表明，余甘子具有抗炎、抗氧化、抗衰老、保肝等作用[3]，而其強(qiáng)烈的抗氧化活性是其生理功能的基礎(chǔ)[4]。果實(shí)采后褐變會直接影響果實(shí)的品質(zhì)和商品價值。果蔬采后的褐變主要是多酚氧化酶（PPO）引起的，多酚氧化酶是一類含Cu元素的膜結(jié)合蛋白，它催化果蔬體內(nèi)的多酚類物質(zhì)氧化形成醌，后者自身縮合或與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成褐色或黑色物質(zhì)。對于余甘子果實(shí)的保鮮，關(guān)鍵就在于抑制PPO的活性。目前已有許多試驗(yàn)研究了不同果實(shí)中的PPO[5-14]，而對于余甘子的相關(guān)研究報道則較少。本試驗(yàn)對余甘子果實(shí)PPO活性的影響因素進(jìn)行了探究，旨在為其采后的保鮮與加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：余甘子果實(shí)（普通品種）購自廣東潮州市農(nóng)貿(mào)市場。

試劑：檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸（VC）、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、焦性沒食子酸、鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚、磷酸、醋酸等均為分析純。

儀器：PHS-3CA型精密酸度計（上海大中分析儀器廠）；UV-2800型紫外分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；16R型高速冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇億通電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PPO酶液的提取 將新鮮、無機(jī)械損傷、無病蟲害的余甘子果實(shí)洗凈，然后取10 g余甘子果肉，加入預(yù)冷的0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖液10 mL于低溫（冰水中）搗碎至勻漿，6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，低溫（0～4 ℃）保存。

1.2.2 最佳底物選擇試驗(yàn) 將各種酚類物質(zhì)（焦性沒食子酸、鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚）分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L溶液作為PPO作用的底物。取底物溶液11.2 mL，加入PPO粗酶提取液0.8 mL，搖勻，于25 ℃保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。在420 nm波長下測定其吸光度（A）并計算PPO相對活性，以確定余甘子果實(shí)PPO作用的最佳底物。

1.2.3 PPO活性測定 采用晏紹慶等[11]的測定方法并稍作修改。將“1.2.2”中選出的最佳底物焦性沒食子酸用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L的溶液作為酶的底物，取底物溶液11.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL，于25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。然后在波長420 nm處比色，測定吸光度A，計算PPO的活性。以每毫升酶液反應(yīng)后每分鐘吸光度值增加0.001定義為1個酶活單位（U）。

PPO活性=ΔA420 nm×VT/（W×VS×0.001×t）

式中，ΔA420 nm為樣品吸光度與空白對照吸光度之差，VT為提取酶液總體積（mL），W為待測材料質(zhì)量（g），VS為測定時取用酶液體積（mL），t為反應(yīng)時間（min）。PPO活性單位為U/（g·min）。

1.2.4 pH對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.5 反應(yīng)溫度對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH為6.0，在不同的溫度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.6 底物濃度對PPO活性的影響 取不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L）的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH為6.0，于25 ℃下保溫5 min，然后用50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.7 抑制劑對PPO活性的影響 將抑制劑抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.02 mol/L的溶液，分別取上述抑制劑2.0 mL，加入焦性沒食子酸（0.14 mol/L）溶液9.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL。在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳底物選擇試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，以焦性沒食子酸為底物時余甘子果實(shí)PPO活性最大，即焦性沒食子酸是余甘子果實(shí)PPO作用的最佳底物。

2.2 pH對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖2可知，余甘子果實(shí)PPO作用的最適pH為6.0，在pH小于3.0和大于9.0時，果實(shí)的PPO活性受抑制的趨勢越來越明顯。這是因?yàn)镻PO是一種含Cu離子的蛋白質(zhì)，在強(qiáng)酸條件下，Cu離子被解離出來使酶失活，而且較高的酸性也使蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酶失活；在堿性條件下，Cu離子與酶蛋白脫離，生成不溶性的Cu（OH）2，也可使酶失活。因此，在進(jìn)行果品加工處理時，可調(diào)節(jié)環(huán)境的pH，使果實(shí)PPO失活，從而減輕其褐變的發(fā)生率。

2.3 反應(yīng)溫度對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

反應(yīng)溫度對PPO活性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，反應(yīng)溫度在0～60 ℃時，余甘子果實(shí)PPO活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，0～10 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，余甘子果實(shí)PPO活性上升迅速；10～30 ℃時，隨溫度升高余甘子果實(shí)PPO活性下降明顯，當(dāng)溫度高于30 ℃時，余甘子果實(shí)PPO活性變化不大，處于較低水平。余甘子果實(shí)PPO活性的峰值出現(xiàn)在10 ℃，即PPO作用的最適溫度為10 ℃，這與紀(jì)淑娟等[14]報道的蜜柚PPO作用的最適溫度為10 ℃相一致。但在0 ℃時發(fā)現(xiàn)余甘子有凍傷現(xiàn)象，所以0 ℃不宜作為其貯存的溫度。

2.4 底物濃度對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖4可知，在供試反應(yīng)體系中，當(dāng)焦性沒食子酸濃度為0.02～0.14 mol/L時，余甘子果實(shí)PPO活性呈上升趨勢，且在0.14 mol/L時達(dá)到最大；當(dāng)焦性沒食子酸濃度為0.14～0.20 mo1/L時，余甘子果實(shí)PPO活性的變化趨于平緩。這是因?yàn)榈孜餄舛容^低時，有一些酶的活性部位并沒有與底物結(jié)合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶活性部位與底物相結(jié)合，使酶促反應(yīng)進(jìn)行；在達(dá)到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結(jié)合，此時酶活性部位被底物飽和，進(jìn)一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達(dá)到最大值。

2.5 抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖5可以看出，4種抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。其抑制效果由強(qiáng)到弱分別為抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、檸檬酸?？箟难釋τ喔首庸麑?shí)PPO活性的抑制效果好于其他3種?？箟难岬?種抑制劑可以作為醌的還原劑，也可以作為酶分子中Cu離子的螯合劑，能夠與酶促褐變的中間產(chǎn)物生成穩(wěn)定無色的產(chǎn)物，阻止了黑色素的生成，從而抑制了PPO的活性。

3 小結(jié)與討論

余甘子果實(shí)的褐變與余甘子PPO活性變化密切相關(guān)，而PPO活性的抑制是多因素綜合作用的結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，余甘子果實(shí)中PPO活性作用的最佳底物為焦性沒食子酸，在該底物作用條件下，余甘子果實(shí)中PPO作用的最適pH為6.0，在pH為5.0～7.0之間活性最大，因此，通過控制果品加工環(huán)境的pH，可在一定程度上減輕果實(shí)褐變的速度。余甘子果實(shí)中PPO作用的最適溫度為10 ℃。底物濃度對余甘子果實(shí)PPO活性也有影響，在焦性沒食子酸處于低濃度時，隨著底物濃度增加，余甘子果實(shí)PPO的活性不斷升高，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.14 mol/L時，PPO的活性達(dá)到最高，之后再增加底物濃度對酶的活性影響不大。抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸等抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性均具有一定的抑制作用。在相同濃度的單一抑制劑作用下，其抑制效果依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸?？箟难釋τ喔首庸麑?shí)PPO活性有較好的抑制作用，而且其抑制效果隨著抗壞血酸濃度的增加而升高。抗壞血酸處理對保持果實(shí)的貯藏品質(zhì)和減少損失有重要意義，其作為一種安全、方便的處理方式，在果蔬保鮮方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

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1.2.3 PPO活性測定 采用晏紹慶等[11]的測定方法并稍作修改。將“1.2.2”中選出的最佳底物焦性沒食子酸用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L的溶液作為酶的底物，取底物溶液11.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL，于25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。然后在波長420 nm處比色，測定吸光度A，計算PPO的活性。以每毫升酶液反應(yīng)后每分鐘吸光度值增加0.001定義為1個酶活單位（U）。

PPO活性=ΔA420 nm×VT/（W×VS×0.001×t）

式中，ΔA420 nm為樣品吸光度與空白對照吸光度之差，VT為提取酶液總體積（mL），W為待測材料質(zhì)量（g），VS為測定時取用酶液體積（mL），t為反應(yīng)時間（min）。PPO活性單位為U/（g·min）。

1.2.4 pH對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.5 反應(yīng)溫度對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH為6.0，在不同的溫度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.6 底物濃度對PPO活性的影響 取不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L）的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH為6.0，于25 ℃下保溫5 min，然后用50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.7 抑制劑對PPO活性的影響 將抑制劑抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.02 mol/L的溶液，分別取上述抑制劑2.0 mL，加入焦性沒食子酸（0.14 mol/L）溶液9.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL。在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳底物選擇試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，以焦性沒食子酸為底物時余甘子果實(shí)PPO活性最大，即焦性沒食子酸是余甘子果實(shí)PPO作用的最佳底物。

2.2 pH對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖2可知，余甘子果實(shí)PPO作用的最適pH為6.0，在pH小于3.0和大于9.0時，果實(shí)的PPO活性受抑制的趨勢越來越明顯。這是因?yàn)镻PO是一種含Cu離子的蛋白質(zhì)，在強(qiáng)酸條件下，Cu離子被解離出來使酶失活，而且較高的酸性也使蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酶失活；在堿性條件下，Cu離子與酶蛋白脫離，生成不溶性的Cu（OH）2，也可使酶失活。因此，在進(jìn)行果品加工處理時，可調(diào)節(jié)環(huán)境的pH，使果實(shí)PPO失活，從而減輕其褐變的發(fā)生率。

2.3 反應(yīng)溫度對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

反應(yīng)溫度對PPO活性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，反應(yīng)溫度在0～60 ℃時，余甘子果實(shí)PPO活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，0～10 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，余甘子果實(shí)PPO活性上升迅速；10～30 ℃時，隨溫度升高余甘子果實(shí)PPO活性下降明顯，當(dāng)溫度高于30 ℃時，余甘子果實(shí)PPO活性變化不大，處于較低水平。余甘子果實(shí)PPO活性的峰值出現(xiàn)在10 ℃，即PPO作用的最適溫度為10 ℃，這與紀(jì)淑娟等[14]報道的蜜柚PPO作用的最適溫度為10 ℃相一致。但在0 ℃時發(fā)現(xiàn)余甘子有凍傷現(xiàn)象，所以0 ℃不宜作為其貯存的溫度。

2.4 底物濃度對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖4可知，在供試反應(yīng)體系中，當(dāng)焦性沒食子酸濃度為0.02～0.14 mol/L時，余甘子果實(shí)PPO活性呈上升趨勢，且在0.14 mol/L時達(dá)到最大；當(dāng)焦性沒食子酸濃度為0.14～0.20 mo1/L時，余甘子果實(shí)PPO活性的變化趨于平緩。這是因?yàn)榈孜餄舛容^低時，有一些酶的活性部位并沒有與底物結(jié)合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶活性部位與底物相結(jié)合，使酶促反應(yīng)進(jìn)行；在達(dá)到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結(jié)合，此時酶活性部位被底物飽和，進(jìn)一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達(dá)到最大值。

2.5 抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖5可以看出，4種抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。其抑制效果由強(qiáng)到弱分別為抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、檸檬酸。抗壞血酸對余甘子果實(shí)PPO活性的抑制效果好于其他3種?？箟难岬?種抑制劑可以作為醌的還原劑，也可以作為酶分子中Cu離子的螯合劑，能夠與酶促褐變的中間產(chǎn)物生成穩(wěn)定無色的產(chǎn)物，阻止了黑色素的生成，從而抑制了PPO的活性。

3 小結(jié)與討論

余甘子果實(shí)的褐變與余甘子PPO活性變化密切相關(guān)，而PPO活性的抑制是多因素綜合作用的結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，余甘子果實(shí)中PPO活性作用的最佳底物為焦性沒食子酸，在該底物作用條件下，余甘子果實(shí)中PPO作用的最適pH為6.0，在pH為5.0～7.0之間活性最大，因此，通過控制果品加工環(huán)境的pH，可在一定程度上減輕果實(shí)褐變的速度。余甘子果實(shí)中PPO作用的最適溫度為10 ℃。底物濃度對余甘子果實(shí)PPO活性也有影響，在焦性沒食子酸處于低濃度時，隨著底物濃度增加，余甘子果實(shí)PPO的活性不斷升高，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.14 mol/L時，PPO的活性達(dá)到最高，之后再增加底物濃度對酶的活性影響不大?？箟难?、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸等抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性均具有一定的抑制作用。在相同濃度的單一抑制劑作用下，其抑制效果依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸?？箟难釋τ喔首庸麑?shí)PPO活性有較好的抑制作用，而且其抑制效果隨著抗壞血酸濃度的增加而升高?？箟难崽幚韺Ρ３止麑?shí)的貯藏品質(zhì)和減少損失有重要意義，其作為一種安全、方便的處理方式，在果蔬保鮮方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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1.2.3 PPO活性測定 采用晏紹慶等[11]的測定方法并稍作修改。將“1.2.2”中選出的最佳底物焦性沒食子酸用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L的溶液作為酶的底物，取底物溶液11.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL，于25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。然后在波長420 nm處比色，測定吸光度A，計算PPO的活性。以每毫升酶液反應(yīng)后每分鐘吸光度值增加0.001定義為1個酶活單位（U）。

PPO活性=ΔA420 nm×VT/（W×VS×0.001×t）

式中，ΔA420 nm為樣品吸光度與空白對照吸光度之差，VT為提取酶液總體積（mL），W為待測材料質(zhì)量（g），VS為測定時取用酶液體積（mL），t為反應(yīng)時間（min）。PPO活性單位為U/（g·min）。

1.2.4 pH對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.5 反應(yīng)溫度對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH為6.0，在不同的溫度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.6 底物濃度對PPO活性的影響 取不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L）的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調(diào)整反應(yīng)體系的pH為6.0，于25 ℃下保溫5 min，然后用50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.7 抑制劑對PPO活性的影響 將抑制劑抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.02 mol/L的溶液，分別取上述抑制劑2.0 mL，加入焦性沒食子酸（0.14 mol/L）溶液9.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL。在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳底物選擇試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，以焦性沒食子酸為底物時余甘子果實(shí)PPO活性最大，即焦性沒食子酸是余甘子果實(shí)PPO作用的最佳底物。

2.2 pH對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖2可知，余甘子果實(shí)PPO作用的最適pH為6.0，在pH小于3.0和大于9.0時，果實(shí)的PPO活性受抑制的趨勢越來越明顯。這是因?yàn)镻PO是一種含Cu離子的蛋白質(zhì)，在強(qiáng)酸條件下，Cu離子被解離出來使酶失活，而且較高的酸性也使蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酶失活；在堿性條件下，Cu離子與酶蛋白脫離，生成不溶性的Cu（OH）2，也可使酶失活。因此，在進(jìn)行果品加工處理時，可調(diào)節(jié)環(huán)境的pH，使果實(shí)PPO失活，從而減輕其褐變的發(fā)生率。

2.3 反應(yīng)溫度對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

反應(yīng)溫度對PPO活性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，反應(yīng)溫度在0～60 ℃時，余甘子果實(shí)PPO活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，0～10 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，余甘子果實(shí)PPO活性上升迅速；10～30 ℃時，隨溫度升高余甘子果實(shí)PPO活性下降明顯，當(dāng)溫度高于30 ℃時，余甘子果實(shí)PPO活性變化不大，處于較低水平。余甘子果實(shí)PPO活性的峰值出現(xiàn)在10 ℃，即PPO作用的最適溫度為10 ℃，這與紀(jì)淑娟等[14]報道的蜜柚PPO作用的最適溫度為10 ℃相一致。但在0 ℃時發(fā)現(xiàn)余甘子有凍傷現(xiàn)象，所以0 ℃不宜作為其貯存的溫度。

2.4 底物濃度對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖4可知，在供試反應(yīng)體系中，當(dāng)焦性沒食子酸濃度為0.02～0.14 mol/L時，余甘子果實(shí)PPO活性呈上升趨勢，且在0.14 mol/L時達(dá)到最大；當(dāng)焦性沒食子酸濃度為0.14～0.20 mo1/L時，余甘子果實(shí)PPO活性的變化趨于平緩。這是因?yàn)榈孜餄舛容^低時，有一些酶的活性部位并沒有與底物結(jié)合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶活性部位與底物相結(jié)合，使酶促反應(yīng)進(jìn)行；在達(dá)到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結(jié)合，此時酶活性部位被底物飽和，進(jìn)一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達(dá)到最大值。

2.5 抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性的影響

由圖5可以看出，4種抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。其抑制效果由強(qiáng)到弱分別為抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、檸檬酸?？箟难釋τ喔首庸麑?shí)PPO活性的抑制效果好于其他3種。抗壞血酸等4種抑制劑可以作為醌的還原劑，也可以作為酶分子中Cu離子的螯合劑，能夠與酶促褐變的中間產(chǎn)物生成穩(wěn)定無色的產(chǎn)物，阻止了黑色素的生成，從而抑制了PPO的活性。

3 小結(jié)與討論

余甘子果實(shí)的褐變與余甘子PPO活性變化密切相關(guān)，而PPO活性的抑制是多因素綜合作用的結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，余甘子果實(shí)中PPO活性作用的最佳底物為焦性沒食子酸，在該底物作用條件下，余甘子果實(shí)中PPO作用的最適pH為6.0，在pH為5.0～7.0之間活性最大，因此，通過控制果品加工環(huán)境的pH，可在一定程度上減輕果實(shí)褐變的速度。余甘子果實(shí)中PPO作用的最適溫度為10 ℃。底物濃度對余甘子果實(shí)PPO活性也有影響，在焦性沒食子酸處于低濃度時，隨著底物濃度增加，余甘子果實(shí)PPO的活性不斷升高，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.14 mol/L時，PPO的活性達(dá)到最高，之后再增加底物濃度對酶的活性影響不大?？箟难?、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸等抑制劑對余甘子果實(shí)PPO活性均具有一定的抑制作用。在相同濃度的單一抑制劑作用下，其抑制效果依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸?？箟难釋τ喔首庸麑?shí)PPO活性有較好的抑制作用，而且其抑制效果隨著抗壞血酸濃度的增加而升高?？箟难崽幚韺Ρ３止麑?shí)的貯藏品質(zhì)和減少損失有重要意義，其作為一種安全、方便的處理方式，在果蔬保鮮方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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