CHI3L1基因多態(tài)性和血清YKL-40水平與支氣管哮喘發(fā)病的關聯(lián)性

陳 敏,賴天文,招軒娜,呂瑩瑩,高拯妮,黃 丹,劉升明

(1.暨南大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科,廣東廣州 510630;2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內科,廣東湛江 524001)

CHI3L1基因多態(tài)性和血清YKL-40水平與支氣管哮喘發(fā)病的關聯(lián)性

陳 敏1,2,賴天文2,招軒娜2,呂瑩瑩2,高拯妮2,黃 丹2,劉升明1

(1.暨南大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科,廣東廣州 510630;2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內科,廣東湛江 524001)

目的:觀察幾丁質酶3類1(CHI3L1)基因多態(tài)性與廣東地區(qū)漢族人群哮喘發(fā)病的關聯(lián)性,探討采用其編碼的幾丁質酶樣蛋白40(YKL-40)評估病情嚴重程度及監(jiān)測病情的臨床意義。方法:入選的251例研究對象分為哮喘組(150例)和正常對照組(101例)。采用Massarray法檢測CHI3L1基因單核苷酸多態(tài)性(SNP),同時檢測哮喘組和對照組研究對象血清YKL-40水平、外周血嗜酸性粒細胞百分比(Eos%)、總Ig E和肺功能,同時將哮喘組分為急性加重期和穩(wěn)定期2個亞組,比較患者血清YKL-40水平的差異。結果:CHI3L1基因位點rs3806448 A/G等位基因在哮喘組和對照組中分布比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),哮喘組患者rs3806448等位基因A頻數明顯高于正常對照組(OR＝1.93,95%CI＝1.30～2.62,χ2＝11.6,P＜0.01);rs3806448基因型為AA患者血清YKL-40水平、總IgE和Eos%高于基因型為GG或AG患者(P＜0.05);而rs3806448基因型為AA患者一秒用力呼氣容積(FEV1)占預計值百分比(FEV1%)低于基因型為GG或AG患者(P＜0.05);哮喘組患者血清YKL-40水平明顯高于正常對照組(P＜0.01),哮喘急性加重組患者血清YKL-40水平高于病情穩(wěn)定組和正常對照組(P＜0.01);哮喘組患者血清YKL-40水平與外周血EOS%及總Ig E水平呈正相關關系(rEos＝0.348,rIgE＝0.437,P＜0.01),與肺功能呈負相關關系(r＝－0.745,P＜0.01)。結論:CHI3L1-rs3806448多態(tài)性與廣東地區(qū)漢族人群的哮喘發(fā)病有關聯(lián),提示血清YKL-40可能是評價哮喘患者病情嚴重程度及監(jiān)測病情變化的一個新生物標志物。

支氣管哮喘;單核甘酸多態(tài)性;幾丁質酶3樣蛋白1

目前全球約有3億支氣管哮喘(bronchial asthma,簡稱哮喘)患者,其中我國約有3千萬哮喘患者。哮喘的病因和發(fā)病機制非常復雜,至今尚未完全闡明。哮喘發(fā)病與多基因有關,同時受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響[1]。近年的研究[2-3]表明:幾丁質酶(chitinase)在哮喘的發(fā)病中具有重要作用。幾丁質酶具有催化幾丁質中β1-4糖苷鍵水解的功能,使幾丁質結構重塑,同時也為有機體提供重要的能量來源。存在于人體內的幾丁質酶家族成員有酸性哺乳動物幾丁質酶(acid mammalian chitinase,AMCase)和殼三糖苷酶(chitotriosidase,CHIT1)及與之結構相似的幾丁質酶樣蛋白,如YKL-39和YKL-40等。YKL-40與幾丁質酶共同具有a(β/α)8TIM的保守結構,因其催化中心的質子供體谷氨酸為異亮氨酸所替代,不具備幾丁質酶的活性,但其具備與幾丁質結合的能力。YKL-40在哮喘患者血液和肺部的含量增加,與哮喘嚴重程度和表皮下基底膜增厚(氣道重塑)有關[4]。幾丁質酶3類1(chitotriosidase 3-like 1,CHI3L1)編碼YKL-40蛋白,且CHI3L1啟動區(qū)的單核苷酸多態(tài)性與血清YKL-40水平、基因表達差異和轉錄水平相關[5-6]。哮喘具有多基因遺傳,具有明顯的遺傳異質性,這意味著某些群體中發(fā)現(xiàn)的遺傳易感基因在另外的群體中不一定能發(fā)現(xiàn)。為了確定CHI3L1基因是否是廣東漢族人群發(fā)生哮喘的危險因素,本文作者采用病例對照法研究CHI3L1啟動子區(qū)域的3個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)(rs10494132、rs3806448及rs2275254)與哮喘發(fā)病、血清YKL-40水平、外周血嗜酸性粒細胞百分比(Eos%)、總免疫球蛋白E(IgE)和肺功能的關聯(lián)性,同時評價哮喘患者血清YKL-40與外周血Eos%、總IgE和肺功能的關聯(lián)性,為哮喘的診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

入選標準采用2009年全球支氣管哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma,GINA)提出的哮喘診斷標準[7]。排除標準:并發(fā)有嚴重心肺疾病患者;并發(fā)有過敏性鼻炎等過敏性疾病的患者;有吸煙史(＞20支/年)的患者;不能進行肺功能測試的患者。2011年1月—2012年12月選取廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院門診或住院的哮喘患者150例,同期在體檢中心選取101名健康體檢者作為正常對照組。哮喘患者又分為急性加重和穩(wěn)定期2個亞組。本研究通過廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會的審核,所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 哮喘患者分組

1.2.1 哮喘急性加重組 哮喘急性加重定義為喘息、氣促、咳嗽和胸悶等癥狀突然發(fā)生,或原有癥狀急劇加重,常有呼吸困難,以一秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,FEV1)降低為其特征[7]。在本研究中,因哮喘急性發(fā)作到門診或急診就診的患者且FEV1＜90%預計值時納入為急性加重組,共50例。排除標準:并發(fā)肺癌、關節(jié)炎、肝硬化、2型糖尿病及口服激素或在4周內曾發(fā)生肺炎的患者。在患者就診后6 h內采集外周血。

1.2.3 哮喘穩(wěn)定期組 哮喘穩(wěn)定期定義為癥狀和肺功能穩(wěn)定至少維持4周[7]。當穩(wěn)定期患者在門診定期隨訪時納入哮喘穩(wěn)定期組,共100例?；颊咴陂T診隨訪時采集外周血。

1.3 基因多態(tài)性檢測

所有研究對象的靜脈血用EDTA抗凝,以全血基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司,德國)抽取DNA,經測定其濃度達20～60 mg·L－1。將提取出來的基因組DNA進行目的基因的擴增。采用Assay Design 3.1軟件(Sequenom公司)進行引物設計并由Ta KaRa寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。在SNP位點處延伸上帶有熒光信號標記單個堿基。PCR反應條件:94℃預變性15 min; 94℃變性20 s,56℃退火30 s,72℃延伸60 s,共40個循環(huán);72℃終末延伸3 min。應用Sequenom Massarray(Sequenom公司,美國)檢測擴增的PCR產物,根據單堿基延伸的等位基因的相對分子質量差異進行基因分型。

1.4 血清YKL-40水平、外周血總IgE和Eos%測定

采用人YKL-40 ELISA試劑盒(Quidel公司,美國)檢測血清YKL-40水平。最低檢測濃度小于20 mg·L－1。總Ig E檢測采用EDTA抗凝管抽取靜脈血2 m L,離心5 min后分離血清,再采用ELISA酶聯(lián)免疫吸附法,用Beckman-coulter特種蛋白分析儀Immage 800儀器進行檢測。采用全自動血液分析儀檢測外周血Eos%,操作過程嚴格按照說明書進行操作。

表1 CHI3L1基因多態(tài)性所在DNA片段的PCR引物及單堿基延伸引物Tab.1 Primers of PCR and single base extension primers of CHI3L1 polymorphism

1.5 統(tǒng)計學分析

分別統(tǒng)計哮喘組和正常對照組基因型分布頻數,經Hardy-Weinberg平衡檢驗后,采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。研究對象年齡、體質量指數(body mass index,BMI)、總IgE、Eos%及FEV1%等以±s表示。年齡、BMI、總IgE、Eos%及FEV1%等組間比較采用t檢驗,2組間性別比較采用χ2檢驗。YKL-40水平呈非正態(tài)分布,應用非參數檢驗包括Mann-Whitney U檢驗和Kruskal-Wallis H檢驗。YKL-40水平、總IgE、Eos%與肺功能的相關性采用Spearman等級相關分析?；蛐秃偷任换虻姆植疾町惒捎忙?檢驗,采用二分類Logistic回歸計算比值比(odds ratio, OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)。

2 結果

2.1 各組研究對象的基本資料

總IgE和Eos%是與哮喘密切相關的2個特征性指標[8-9]。本研究結果表明:與正常對照組比較,哮喘組患者總IgE和Eos%明顯升高,FEV1%明顯降低(P＜0.01);與哮喘穩(wěn)定期患者比較,哮喘急性加重期患者FEV1%明顯降低(P＜0.01)。見表2。

表2 各組研究對象的基本情況Tab.2 Basic information of subjects in various groups

2.2 基因多態(tài)性測定

與正常對照組比較,哮喘組患者CHI3L1基因啟動子rs3806448等位基因A出現(xiàn)頻數升高(P＜0.01),哮喘患者rs3806448等位基因A與哮喘發(fā)病高度相關(OR＝1.93,95%CI＝1.30～2.62, χ2＝11.6,P＜0.01)。rs3806448特征性質譜圖見圖1。rs10494132(T/C)和rs2275254(A/G)位點多態(tài)性2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 CHI3L1部分基因多態(tài)性檢測Tab.3 Detection of parts of CHI3L1 polymorphisms[n(η/%)]

圖1 rs3806448的AA、GG和AG特征質譜圖Fig.1 Characteristic mass spectra of genotype AA,GG and AG at rs3806448

2.3 rs3806448多態(tài)性與哮喘患者YKL-40、總IgE、Eos%及肺功能的關系

rs3806448基因型為AA患者血清YKL-40水平、總Ig E和Eos%高于基因型GG或AG患者(P＜0.05);而rs3806448基因型AA患者FEV1%低于基因型為GG或AG患者(P＜0.05)。見表4。

2.4 各組研究對象血清YKL-40水平

哮喘組患者血清YKL-40水平[(53.3± 7.1)μg·L－1]高于正常對照組[33.8± 4.0)μg·L－1](P＜0.01)。哮喘急性發(fā)作組患者血清YKL-40水平[(56.2±6.9)μg·L－1)]高于哮喘穩(wěn)定期患者[(52.2±6.8)μg·L－1)](P ＜0.05)及正常對照組(P＜0.01)。

2.5 血清YKL-40水平與哮喘患者總Ig E、Eos% 及FEV1%的相關性

哮喘患者血清YKL-40水平與總Ig E(r＝0.437,P＜0.01)及Eos%(r＝0.348,P＜0.01)呈正相關關系,而與FEV1%(r＝－0.745,P＜0.01)呈負相關關系。

表4 rs3806448位點不同基因型哮喘患者YKL-40水平、總IgE、Eos%和FEV1%Tab.4 Levels of YKL-40,total IgE,Eos%and FEV1%of asthma patients with different genotypes of rs3806448

3 討論

幾丁質是廣泛存在于自然界的一種含氮多糖類生物性高分子。幾丁質酶是動植物在寄生蟲、昆蟲入侵時產生的酶,可降解幾丁質。人類無幾丁質,但在基因組中有多種幾丁質酶的基因殘留,如AMCase和CHIT1等,其表達產物為與之結構相似的幾丁質酶樣蛋白,如YKL-39和YKL-40。研究[10]發(fā)現(xiàn):幾丁質酶及殼多糖酶樣蛋白YKL-40是炎癥的標記物。編碼YKL-40的CHI3L1基因最近被證實與哮喘易感性相關。本研究對CHI3L1基因啟動子區(qū)域的3個多態(tài)性位點進行檢測,結果顯示:rs3806448 G/A位點變異與哮喘發(fā)病有關聯(lián),進一步驗證了CHI3L1基因與哮喘易感性的關系。CHI3L1基因位于1q32-q32高度保守的區(qū)域,總長度約為8 000 bp,共包含10個外顯子[11],參與多種疾病的炎癥反應和組織結構重塑等病理過程。其機制可能為CHI3L1啟動子區(qū)域的一個SNP (s4950928,－131Cy G)引起轉錄因子連接位點的破壞,導致YKL-40基礎表達水平下降,而產生哮喘的易感性。因此,變異的－131G等位基因與抗哮喘、氣道高反應性和肺功能下降的保護作用相關[]。

Rathcke等[13]報道:rs3806448 G/A啟動的多態(tài)性與成人和兒童變應性哮喘發(fā)病有關(Padult＝0.000 01,Ppediatric＝0.000 2),也與患者外周血總IgE水平有關。Chatterjee等[14]在印度人群中發(fā)現(xiàn):rs3806448基因多態(tài)性與過敏性哮喘以及血清總Ig E水平具有顯著相關性。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn):CHI3L1啟動子區(qū)域的rs3806448多態(tài)性與廣東地區(qū)漢族人群哮喘發(fā)病相關。本研究進一步發(fā)現(xiàn),rs3806448基因型GG或AG患者血清YKL-40水平、總IgE和Eos%低于基因型AA患者,而FEV1%高于基因型AA患者,結果表明: CHI3L1基因的SNP是哮喘的一個易感因素,并且攜帶A等位基因的患者,其患哮喘的風險增加。本文作者推測:該位點可能參與了基因表達和功能的調節(jié),但rs3806448在哮喘的具體作用機制仍未清楚。本研究發(fā)現(xiàn):基因型AA患者血清YKL-40水平明顯降低,因此推測這個位點可能通過影響YK-L40的水平來影響哮喘的發(fā)病,這是本文作者進一步研究的目標。

本研究結果顯示:在廣東地區(qū)人群中rs10494132和rs2275254基因多態(tài)性與哮喘無關聯(lián)。而Chatterjee等[14]發(fā)現(xiàn):rs10494132多態(tài)性與印度人群血清總IgE水平有關,認為rs10494132 的SNP改變了CHIA啟動子的轉錄活性,C突變成T后八聚體轉錄因子-1的結合位點失去作用。本研究未發(fā)現(xiàn)rs10494132多態(tài)性與漢族人群哮喘發(fā)病相關。Wu等[15]研究發(fā)現(xiàn):CHIA多態(tài)性(含 rs10494132)與哮喘無關。Rathcke等[13]在成人及兒童中未發(fā)現(xiàn)rs10494132多態(tài)性與哮喘發(fā)病有關(Padult＝0.46,Ppediatric＝0.76)。本文作者未發(fā)現(xiàn)rs2275254多態(tài)性與哮喘有關,這與Rathcke等[13]的報道一致。上述研究結論不完全相同,可能原因是哮喘是一種異質性疾病,CHI3L1基因是否在普通哮喘人群或是僅在某一特定的哮喘表型起作用仍不清楚。此外,不同研究對象和研究設計可能導致研究結果的差異。因此,這些相關結論有待于大樣本和多種族人群進一步驗證。

哮喘氣道炎癥的評估是哮喘病情評價的重要方面。YKL-40可通過促進哮喘患者Th2活化、分化并減少其凋亡,增加Th2數量,在哮喘慢性氣道炎癥中起著重要作用[16]。Tang等[5]研究發(fā)現(xiàn):哮喘患者血清YKL-40水平明顯升高,且與哮喘患者的嚴重程度有關。Konradsen等[17]在兒童哮喘患者的研究中發(fā)現(xiàn):病情重、治療抵抗的哮喘患兒相對于哮喘控制良好的患兒和正?；純篩KL-40水平明顯升高,因此YKL-40可預示病情的嚴重程度,且與CHI3L1基因型有關聯(lián)。本研究結果顯示:哮喘患者血清YKL-40水平與哮喘的急性加重有關,且與患者外周血總IgE及Eos%呈正相關關系,與FEV1%呈負相關關系。這些結果提示:YKL-40可能參與了哮喘的慢性氣道炎癥過程,Tang等[18]研究發(fā)現(xiàn):YKL-40可通過誘導支氣管上皮細胞產生IL-8,參與氣道炎癥的形成甚至導致支氣管平滑肌細胞的增殖和遷移。因此YKL-40可能是一種預測哮喘患者病情嚴重程度及肺功能下降的生物標記物。但其在哮喘發(fā)病中具體的、確切的作用機制仍需進一步深入研究。

綜上所述,本研究結果表明:CHI3L1啟動子區(qū)域的rs3806448多態(tài)性與廣東地區(qū)漢族人群哮喘發(fā)病有關,rs3806448基因型AA是哮喘發(fā)病的危險因素。哮喘患者血清YKL-40水平升高,與哮喘的嚴重程度有關,與外周血總IgE和Eos%呈正相關關系,與FEV1%呈負相關關系。因此,血清YKL-40可能是一種預測哮喘急性發(fā)作及評價病情嚴重程度的生物標記物。

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Correlation between CHI3L1 polymorphism and serum YKL-40 and bronchial asthma

CHEN Min1,2,LAI Tian-wen2,ZHAO Xuan-na2,LYU Ying-ying2,GAO Zheng-ni2,HUANG Dan2,LIU Sheng-ming1
(1.Department of Respiratory Medicine,First Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou 510630,China; 2.Department of Respiratory Medicine,Affiliated Hospital,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,China)

ObjectiveTo investigate the association between CHI3L1 polymorphism and asthma in the Han population of Guangdong,and to explore the clinical values of chitinase-like protein YKL-40 in evaluating disease severity and monitoring the progression of the disease.MethodsTotal 251 objects were divided into asthma group (n＝150)and control group(n＝101).The single nucleotide polymorphism(SNP)at CHI3L1 gene was detected with Massarray method.The serum YKL-40 levels,total IgE levels,peripheral blood eosinophil percentage (Eos%)of the objects in asthma and control groups were detected.The asthma patients were divied into asthma exacergation group and stable group,and the serum YKL-40 levels were compared.ResultsThe distribution of A/ G at rs3806448 of CHI3L1 had significant difference between asthma and control groups(P＜0.01),and the frequency of A allele at rs3806448 of the patients in asthma group was significantly higher than that in control group (OR＝1.93,95%CI＝1.30－2.62,χ2＝11.6,P＜0.01).The serum YKL-40 levels,total Ig E and Eos%ofthe patients with AA at rs3806448 were higher than those of the patients with GG or AG at rs3806448(P＜0.05); the FEV1%of the patients with AA was lower than those of the patients with GG or AG at rs3806448(P＜0.01).The serum YKL-40 level of the patients in asthma group was significantly higher than that in normal control group (P＜0.01),and the serum YKL-40 level of the patients in asthma exacergation group was higher than those in asthma stable group and normal control group(P＜0.01).The serum YKL-40 level of the patients in asthma group was positively correlated with the peripheral blood Eos%and total Ig E level(rEos＝0.348,rIgE＝0.437,P＜0.01),and was negatively correlated with the lung function(r＝－0.745,P＜0.01).Conclusion The polymorphism of CHI3L1-rs3806448 may correlate with asthma of Han population in Guangdong area.The serum YKL-40 may be a new biomarker to evaluate asthma disease severity and helpful for monitoring illness stage.

bronchial asthma;single nucleotide polymorphism;chitotriosidase 3-like 1

R394;R562

A

2013-12-24

廣東省科技廳科技計劃項目資助課題(2010B031600285)

陳 敏(1976－),男,廣東省興寧市人,副主任醫(yī)師,醫(yī)學碩士,主要從事支氣管哮喘防治的研究。

劉升明(Tel:020-38688066,E-mail:tlsm＠jnu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1058-06

10.13481/j.1671-587x.20140529