大鼠齦溝液吸潮紙尖采集方法的建立及其評(píng)價(jià)

左志剛,胡 敏,劉 珊,李志敏,姜 歡,李洪發(fā)

(1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科,天津 300070;2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科,吉林長(zhǎng)春 130021; 3.天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所,天津 300051)

大鼠齦溝液吸潮紙尖采集方法的建立及其評(píng)價(jià)

左志剛1,胡 敏2,劉 珊3,李志敏1,姜 歡2,李洪發(fā)1

(1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科,天津 300070;2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科,吉林長(zhǎng)春 130021; 3.天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所,天津 300051)

目的:建立并評(píng)價(jià)大鼠齦溝液(GCF)吸潮紙尖采集方法,為大鼠齦溝液分析奠定基礎(chǔ)。方法:選取健康雄性大鼠20只,隨機(jī)分為GCF組和唾液組,每組各10只。15＃吸潮紙尖分別采集GCF組大鼠右上第一磨牙腭側(cè)齦溝內(nèi)液體和唾液組大鼠唾液。樣本離心后進(jìn)行SDS-PAGE分析及蛋白豐度檢測(cè),分析2組樣本的蛋白成分。結(jié)果:GCF組樣本電泳結(jié)果可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白質(zhì)條帶,尤以66 000處條帶亮度最高。唾液組樣本在相對(duì)分子質(zhì)量約為66 000、60 000和48 000附近隱約可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶,條帶亮度較低。2組樣本66 000條帶處蛋白豐度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:GCF組樣本的蛋白條帶數(shù)量以及種類不同于唾液組樣本,證明本實(shí)驗(yàn)利用15＃吸潮紙尖袋內(nèi)多次取樣法可排除唾液、血液干擾,成功采集大鼠GCF。

齦溝液;吸潮紙尖;蛋白分析;大鼠,Wistar

齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)是結(jié)締組織內(nèi)的液體不斷通過(guò)齦溝內(nèi)壁上皮和結(jié)合上皮進(jìn)入齦溝內(nèi)所形成[1],是唯一直接從體液滲出的液體。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于GCF成分的研究多以人為研究對(duì)象,動(dòng)物GCF采集分析的研究并不多見(jiàn)。濾紙條法是目前最常用的GCF采集方法,國(guó)內(nèi)外學(xué)者[2-5]采用濾紙條法多選用Whatman 3號(hào)濾紙條作為主要材料采集動(dòng)物GCF,其缺點(diǎn)如下:①濾紙條2 mm的寬度增加了插入牙周袋的難度;②濾紙條兩直角鋒利,沿牙面插入牙周袋內(nèi)時(shí),加大牙周袋內(nèi)壁出血的幾率,使采集的樣本呈血性;③濾紙條需要手工裁剪成10 mm×2 mm規(guī)格的長(zhǎng)方形,占用工作人員的大量時(shí)間,且精確度不佳,操作時(shí)夾持不便;④失誤操作容易使GCF和唾液混淆,造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

本研究結(jié)合目前研究條件,嘗試?yán)梦奔埣獠杉笫驡CF。吸潮紙尖是牙科專用根管清洗材料,其主要成分是棉纖維,吸水性強(qiáng),60 s內(nèi)吸紅汞溶液遷移距離10 mm,41℃水中不分解。其相對(duì)于傳統(tǒng)濾紙條的優(yōu)點(diǎn)如下:①吸潮紙尖是外型具有一定錐度的圓柱體,沒(méi)有兩個(gè)直角尖,插入牙周袋時(shí)順暢,不易劃破袋內(nèi)壁組織,且其規(guī)格齊全,其長(zhǎng)度、錐度和直徑符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),不同規(guī)格的紙尖在夾持部位用不同顏色標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)牙周袋口松緊和插入時(shí)堅(jiān)挺的程度選擇合適的型號(hào),降低了插入牙周袋的難度;②吸潮紙尖具有良好的彈性和相當(dāng)?shù)挠捕?縱向強(qiáng)度高,不易劃破袋內(nèi)壁組織,減少了采樣插入牙周袋內(nèi)刺破袋內(nèi)壁組織造成出血的機(jī)率,去除了樣本被血液污染的干擾因素;③吸潮紙尖采樣操作應(yīng)用效果優(yōu)于Whatman 3號(hào)濾紙條,解決了操作者夾持柄問(wèn)題,省去手工裁剪操作。本研究通過(guò)SDS-PAGE分析樣本的蛋白成分,排除了唾液對(duì)采集樣本純度的干擾,證明所采集樣本為大鼠GCF,成功建立大鼠GCF吸潮紙尖采集方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器20只健康雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量為(0.25±0.02)kg,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào): 0015004)。速眠新和蘇醒靈(吉林大學(xué)和平校區(qū)提供),丙烯酰胺、N,N’-亞甲雙丙烯酰胺和N, N,N’,N’-四甲基二乙胺(美國(guó)Sigma公司),十二烷基硫酸鈉和L-甘氨酸(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司),磷酸酯酶(天津市化學(xué)試劑研究所),低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),考馬斯亮藍(lán)R-250(長(zhǎng)春寶泰克生物技術(shù)有限公司)。15＃吸潮紙尖(北京達(dá)雅鼎醫(yī)療器械有限公司),Mikro 22R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich-Zentrifugen公司),HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子開(kāi)發(fā)公司),DYC-242型垂直電泳槽和DYY-5型電泳儀(北京六一儀器廠),Phast Image掃描儀(Pharmacia LKB,瑞典),微量振蕩器MH-1(江蘇海門(mén)其林醫(yī)用儀器廠),超低溫冰箱(－80℃)和低溫冰箱(－20℃)(日本Sanyo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組20只健康雄性Wistar大鼠分籠喂養(yǎng),自由飲水,室溫控制在約25℃,隨機(jī)分為GCF組和唾液組,每組10只。15＃吸潮紙尖分別采集GCF組大鼠右上第一磨牙腭側(cè)齦溝內(nèi)液體和唾液組大鼠唾液。

1.3 取 樣大鼠經(jīng)速眠新(0.8～1.2 m L·kg－1)肌注麻醉后仰臥固定,置開(kāi)口器(圖1,見(jiàn)插頁(yè)五)。將GCF組大鼠右上磨牙頰側(cè)以棉卷隔濕,氣槍吹干受試牙面及周圍牙齦黏膜,鈍性牙周探針工作端背部輕壓受試牙腭側(cè)牙齦邊緣,使游離齦與牙面輕微分開(kāi),將預(yù)先剪掉尖端0.5 mm并已高溫高壓消毒的15＃吸潮紙尖輕輕插入右上第一磨牙近、遠(yuǎn)中腭側(cè)齦溝內(nèi)至有輕微阻力即停止(約1.0 mm),留置30 s后取出,間隔1 min后重復(fù)2次,帶血樣本棄去,立即將紙尖密封于已消毒好的微型離心管中。15＃吸潮紙尖采集唾液組大鼠舌下區(qū)唾液,置于已高溫高壓消毒好的微型離心管中。

1.4 樣本處理各組樣本提取后,立即加入1%磷酸鹽緩沖液(PBS,p H 7.2)120μL,常溫下洗脫1 h,15 000 r·min－1離心5 min,提取100μL上清液,－80°保存。

1.5 SDS-PAGE分析制備凝膠,取經(jīng)處理好的樣本進(jìn)行SDS-PAGE分析,電泳后凝膠采用考馬斯亮藍(lán)R250染色。脫色后使用硝酸銀染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。銀染色凝膠用Phast Image掃描儀進(jìn)行掃描,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率測(cè)定各樣本條帶蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量,并進(jìn)行各條帶的定量分析。SDS-PAGE電泳的某一蛋白質(zhì)條帶的光密度(A)值與該條帶面積乘積為此條帶的豐度(abundance),反映該條帶蛋白質(zhì)的水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組樣本中所含蛋白條帶數(shù)和蛋白豐度以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE電泳分析GCF組樣本電泳結(jié)果:清晰可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白質(zhì)條帶,其中除28 000處蛋白質(zhì)條帶亮度略低外,其他條帶亮度均高,尤以66 000處亮度最高,在相對(duì)分子質(zhì)量為66 000～116 000范圍內(nèi),可見(jiàn)3～4條亮度高低不等的蛋白質(zhì)條帶。唾液組樣本電泳結(jié)果:在相對(duì)分子質(zhì)量約為66 000、60 000和48 000處隱約可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶,條帶亮度較低。見(jiàn)圖2。

2.2 2組蛋白條帶數(shù)對(duì)比分析2組樣本蛋白條帶數(shù)目不同,GCF組為(7.400±0.699)條蛋白帶,唾液組為(3.400±0.699)條蛋白帶,二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 2組蛋白豐度應(yīng)用Phast Image掃描儀掃描各樣本主要蛋白的蛋白豐度,2組樣本相對(duì)分子質(zhì)量66 000處蛋白的蛋白豐度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖2 GCF組和唾液組大鼠樣本SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Electrophoregram of rat samples in GCF group and saliva group detected by SDS-PAGELane 1:Standard protein marker;Lane 2:GCF group;Lane 3:Saliva group.

表1 GCF組和唾液組樣本蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Determination results of protein abundance of samples in GCF group and saliva group(±s)

表1 GCF組和唾液組樣本蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Determination results of protein abundance of samples in GCF group and saliva group(±s)

?P＜0.05 compared with GCF group.“－”:No protein bands.

Group Protein abundance 77 000 66 000 60 000 55 000 51 000 48 000 28 000 GCF 0.35±0.24 0.57±0.33 －0.34±0.28 0.37±0.23－0.26±0.21 Saliva－0.20±0.16?0.19±0.14－－0.17±0.13－

3 討論

口腔環(huán)境中的液體包括唾液與GCF。唾液是由涎腺分泌的,經(jīng)過(guò)導(dǎo)管系統(tǒng)排入口腔,廣泛存在于口腔環(huán)境中。GCF的成分與血清相近,因?yàn)槠涑煞种饕獊?lái)源于血清,含有電解質(zhì)、氨基酸和免疫球蛋白等,具有抗菌和增強(qiáng)牙齦免疫的能力。GCF的其他成分來(lái)源于細(xì)菌、牙周局部細(xì)胞產(chǎn)生的間質(zhì)液及上皮和結(jié)締組織的破壞產(chǎn)物等[6]。在牙周組織病變或改建過(guò)程中,GCF的成分可能發(fā)生微量改變[7-12]。目前國(guó)內(nèi)外GCF研究[13-15]已經(jīng)涉足到口腔醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科,包括口腔修復(fù)科、口腔種植科、正畸科和兒科等。近年來(lái)越來(lái)越多的研究[16]發(fā)現(xiàn):牙周病與全身疾病密切相關(guān),并且由于GCF具有方便、無(wú)創(chuàng)和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),GCF的研究已不僅僅局限在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域范疇,而是深入到其他臨床醫(yī)學(xué)之中,應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

正常情況下,齦溝內(nèi)存在菌斑微生物及其代謝產(chǎn)物,且齦溝內(nèi)始終有滲透梯度的變化,故齦溝內(nèi)有少量GCF聚積。GCF的采集方法一般有齦溝沖洗法、濾紙條法和微吸管法,采集方法不同,GCF的質(zhì)和量亦有差異。齦溝沖洗法主要適合于研究齦溝內(nèi)細(xì)胞種類的鑒定和數(shù)目及功能的分析,短時(shí)間內(nèi)限定位點(diǎn)的齦溝徹底沖洗法可獲得代表性齦溝內(nèi)樣本[17]。濾紙條法和微吸管法主要用于GCF的生化分析。微吸管法可定量采集較大量的GCF,但缺點(diǎn)是易對(duì)袋壁組織產(chǎn)生較大的刺激,引起毛細(xì)血管通透性增加,使GCF樣本被血清稀釋和“污染”[18],且此法的誤差較大。濾紙條法是目前最常用的方法,該法操作方便,對(duì)組織無(wú)損傷,而且誤差小,重復(fù)性好。濾紙條法又分為袋內(nèi)法和袋外法,袋外法避免了濾紙插入時(shí)對(duì)齦溝上皮的物理性刺激,但獲得的GCF量較少,可能導(dǎo)致GCF被唾液污染;袋內(nèi)法較袋外法獲得的GCF量多,但對(duì)局部的刺激可能導(dǎo)致血清稀釋作用。由此可見(jiàn),在采集量少的GCF時(shí)很容易被存在于整個(gè)口腔的唾液污染,所以本研究對(duì)采集樣本進(jìn)行蛋白分析,比較GCF組樣本與唾液組樣本蛋白條帶數(shù)及蛋白種類,證明本實(shí)驗(yàn)利用吸潮紙尖在采集過(guò)程中可以排除唾液干擾,成功采集大鼠GCF。

本研究結(jié)果顯示:GCF組樣本蛋白條帶與唾液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于蛋白質(zhì)是GCF的重要成分,其來(lái)源于血漿、宿主細(xì)胞的產(chǎn)物、組織破壞降解產(chǎn)物、菌斑及其產(chǎn)物。唾液中99%是水,有機(jī)物主要是唾液淀粉酶、黏多糖、黏蛋白和溶菌酶等,無(wú)機(jī)物有鈉、鉀、鈣、氯和硫氰離子等,蛋白含量很少。所以,蛋白質(zhì)含量多的GCF電泳會(huì)出現(xiàn)較多的蛋白條帶,而蛋白含量少的唾液則會(huì)出現(xiàn)較少的蛋白條帶。SDS-PAGE結(jié)果顯示: GCF組樣本和唾液組樣本中所含蛋白質(zhì)種類也不相同。GCF組樣本中可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白質(zhì)條帶,條帶亮度較高,該結(jié)果與周華等[19]對(duì)人GCF蛋白質(zhì)成分的電泳分析結(jié)果相似,且與血清蛋白質(zhì)區(qū)帶相一致,說(shuō)明這些蛋白是GCF的主要血清蛋白質(zhì);唾液組樣本在相對(duì)分子質(zhì)量約為66 000、60 000和48 000處隱約可見(jiàn)亮度較低的蛋白質(zhì)條帶,GCF組樣本中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)在唾液組樣本中未檢測(cè)到,而相對(duì)分子質(zhì)量為60 000和48 000的蛋白質(zhì)只在唾液組樣本中檢測(cè)到,相對(duì)分子質(zhì)量為66 000的蛋白質(zhì)在2組樣本中均檢測(cè)出, 但GCF組樣本該蛋白質(zhì)的蛋白豐度值高于唾液組樣本。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:GCF組樣本的蛋白質(zhì)條帶無(wú)論是數(shù)量還是種類顯著多于唾液組樣本的蛋白質(zhì)條帶,說(shuō)明GCF組樣本的蛋白質(zhì)成分更復(fù)雜,由此可將二者區(qū)分,證明利用吸潮紙尖可以成功采集到未被唾液污染的大鼠GCF樣本。

Johnson等[20]通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明:吸潮紙尖的吸潮性、分離洗脫的回收率和采集臨床樣本的檢測(cè)效果均與傳統(tǒng)濾紙條無(wú)明顯差異。本實(shí)驗(yàn)選擇15＃吸潮紙尖代替濾紙條采集GCF,在采集及貯存過(guò)程中,需注意以下幾點(diǎn)情況:①在實(shí)驗(yàn)前減去吸潮紙尖尖端5 mm處以增加其前端強(qiáng)度;②操作須在安靜、平靜的狀態(tài)下進(jìn)行,操作者不宜緊張,采集過(guò)程中應(yīng)細(xì)致、準(zhǔn)確、謹(jǐn)慎;③由于大鼠口角不易完全拉開(kāi),且頰側(cè)前庭溝軟組織較多,頰側(cè)術(shù)區(qū)視野不宜完全暴露,故本實(shí)驗(yàn)選擇采集上頜第一磨牙腭側(cè)近遠(yuǎn)中部位齦溝液;④GCF采集前充分干燥牙齒及周圍組織,用鈍性牙周探針工作端背部輕壓受試牙腭側(cè)牙齦邊緣,使游離齦與牙面輕微分開(kāi),易于紙尖的插入;⑤紙尖插入至有輕微阻力即停止(約1.0 mm),留置30 s后取出,可見(jiàn)紙尖前端約2 mm處為透明色液體浸漬;⑥由于吸潮紙尖采集GCF量較少,且為減小第1次取樣時(shí)齦溝內(nèi)可能存留唾液的干擾,本實(shí)驗(yàn)采取多次取樣法,即間隔1 min后再重復(fù)取樣2次;⑦帶血樣本棄去;⑧本實(shí)驗(yàn)采用洗提法加離心法處理樣本;⑨樣本以PBS作為緩沖液,－80℃保存。

在以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,由于誤操作容易使GCF和口腔中的唾液、血液等其他液體混淆,造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。在本實(shí)驗(yàn)中,取樣時(shí)棄去帶血樣本排除了血液的干擾。

綜上所述,利用15＃吸潮紙尖袋內(nèi)多次取樣法可以成功采集大鼠GCF,排除了唾液、血液等口腔中其他液體的干擾,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中GCF的分析奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment and evaluation of method to collect rat gingival crevicular fluid by using absorbent paper points

ZUO Zhi-gang1,HU Min2,LIU Shan3,LI Zhi-min1,JIANG Huan2,LI Hong-fa1
(1.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300070, China;2.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 3.Institute of Cardiovascular Diseases,Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300051,China)

ObjectiveTo establish and evaluate the method to collect the rat gingival crevicular fluid(GCF)by using absorbent paper points,and to lay foundation for analysis on GCF.Methods20 healthy male rats were selected and randomly divided into GCF group and saliva group.The GCF of the right upper molar gingival trough of the rats in GCF group and the saliva of the rats in saliva group were collected by using 15＃absorbent paper points.The SDS-PAGE analysis and abundance detection were applied to analyze the protein bands of the samples in two groups.ResultsThe SDS-PAGE analysis identified the proteins at 77 000,66 000,55 000,51 000,and 28 000,especially 66 000 in GCF group.While saliva group had lower brightness protein bands at 66 000,60 000, and 48 000.The data of protein abundance of 66 000 between two groups had statistically significant difference (P＜0.05).ConclusionThe number and types of the protein bands are different between GCF Group and saliva group,so using 15＃absorbent paper points can collect the rat GCF successfully.

gingival crevicular fluid;absorbent paper points;protein analysis;rats,Wistar

R783.5

A

2013-11-27

吉林省科技廳科研基金資助課題(20080042-1);天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金青年項(xiàng)目資助課題(2012KYQ13)

左志剛(1982－),男,河北省張家口市人,主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事口腔正畸學(xué)研究。

李洪發(fā)(Tel:022-23332097,E-mail:leehongfa＠yahoo.com.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1028-05

10.13481/j.1671-587x.20140524