低分子殼聚糖的抗肝纖維化作用及其對TLR4表達的影響

馬佳男,敬海峰,張春梅,董友杰,何海濤,韓 旭,費 瑞

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院細胞生物學系,吉林長春 130021; 2.吉林大學基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學實驗教學中心,吉林長春 130021)

低分子殼聚糖的抗肝纖維化作用及其對TLR4表達的影響

馬佳男1,敬海峰2,張春梅1,董友杰1,何海濤1,韓 旭1,費 瑞1

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院細胞生物學系,吉林長春 130021; 2.吉林大學基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學實驗教學中心,吉林長春 130021)

目的:闡明低分子殼聚糖(LMCTS)對四氯化碳(CCl4)誘導大鼠肝纖維化的抑制作用,探討其對Toll樣受體4(TLR4)表達的影響,為開發(fā)臨床治療肝纖維化的天然候選藥物奠定基礎。方法:將72只雄性Wistar大鼠隨機均分空白對照組、CCl4組(模型組)、甘利欣(DG)組和50、100及150 mg·kg－1LMCTS組(低、中和高劑量組)。除空白對照組外,其余5組大鼠腹腔注射40%CCl4植物油(1.75 m L·kg－1),每周2次,共8周;空白對照組大鼠腹腔注射等量100%植物油。從第9周起,DG組及LMCTS組大鼠分別灌胃給予DG和LMCTS(每天1次,共4周)。實驗結束后檢測各組大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)的活性,光鏡下觀察肝組織病理學改變,并采用RT-PCR和Western blotting法檢測TLR4表達情況。結果:血清學指標,中和高劑量LMCTS組大鼠血清ALT、AST和ALP活性均低于模型組(P＜0.05);與低劑量LMCTS組比較,中劑量LMCTS組ALP活性明顯降低(P＜0.05),而ALT和AST活性降低不明顯(P＞0.05);高劑量LMCTS組ALT、AST和ALP活性與中劑量LMCTS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。HE染色,模型組大鼠部分肝細胞脂肪變性,有明顯的炎性細胞浸潤和膠原纖維增生,肝小葉破壞明顯,而LMCTS組大鼠肝組織的變化有所減輕。RT-PCR和Western blotting法,與模型組比較,LMCTS組大鼠肝組織中TLR4表達水平降低(P＜0.05或P＜0.01),以高劑量LMCTS組最為明顯,不同劑量組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論:高劑量LMCTS具有良好的降低肝纖維化大鼠血清轉氨酶活性和改善肝纖維化大鼠肝功能的作用,且此過程與TLR4表達水平降低有關。

低分子殼聚糖;四氯化碳;肝纖維化;Toll樣受體4

肝纖維化是慢性肝臟疾病進程中可變的中間狀態(tài),如給予有效干預和治療,其肝病進程可延緩甚至逆轉[1-2]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是細胞表面識別病原相關分子的一個重要模式識別受體,可接受脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的刺激作用,誘導炎癥等多種疾病的發(fā)生[4-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn):在活化的肝星狀細胞中存在完整的TLR4信號轉導通路,而肝星狀細胞的活化又是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。低分子殼聚糖(low molecular weight chitosan,LMCTS)是自然界中唯一帶正電荷的堿性氨基多糖。與殼聚糖相比,LMCTS有較高溶解度,易被機體吸收和利用,且具有提高人體免疫力、延緩衰老、抑制癌細胞轉移和強化肝功能等作用[7-8]。目前,采用LMCTS干預肝纖維化的研究較少,而其是否可通過TLR4信號轉導通路抑制肝纖維化進程尚不十分清楚,國內外也未見相關報道。本實驗通過研究LMCTS對大鼠肝纖維化的干預作用,探討TLR4在該過程中作用,旨在為進一步研究LMCTS干預肝纖維化的作用機制和開發(fā)臨床治療肝纖維化的天然候選藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑Wistar雄性清潔級大鼠,體質量180～200 g,由吉林大學實驗動物中心提供(動物合格證號:吉2000-042)。正常光照,室溫飼養(yǎng),自由攝食飲水。LMCTS(Mr＝5 000)購于濟南海得貝海洋生物工程有限公司;甘利欣(diammonium glycyrrhizinate,DG)(H10940191)由江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。四氯化碳(CCl4)由北京化工廠生產(chǎn);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購于南京建成生物工程研究所; TLR4多克隆抗體購于Abcam公司;羊抗兔IgG購于天津三箭生物技術有限公司;RIPA裂解液、Trizol購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;第1鏈cDNA合成試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 動物分組和大鼠肝纖維化模型制備72只雄性Wistar大鼠隨機分6組:空白對照組、CCl4組(模型組)、甘利欣(DG)組和50、100、150 mg·kg－1LMCTS組(低、中、高劑量組),每組12只。參照鄺勝利等[9]利用CCl4誘導大鼠肝纖維化模型的方法,空白對照組大鼠以1.75 m L·kg－1腹腔注射植物油,其他各組大鼠按1.75 m L·kg－1腹腔注射40%CCl4植物油混合液(CCl4∶植物油＝4∶6),每周2次,共8周,以血清學指標增加及解剖觀察肝組織損傷程度判定模型成功。模型復制完成后,從第9周起,各實驗組灌胃給藥,劑量和藥物如下:空白對照組和模型組每日按5 m L·kg－1給予生理鹽水灌胃;DG組每日按50 mg·kg－1劑量給予甘利欣;參照Santhosh等[10]方法并結合本文作者的前期實驗[11],低、中和高劑量LMCTS組大鼠每日分別按50、100和150 mg·kg－1給予LMCTS。每日1次,共28 d。

1.3 血清學指標檢測連續(xù)灌胃28 d后,各組大鼠禁食不禁水12 h,用25%烏拉坦麻醉,腹主動脈取血,靜止1 h,3 000 r·min－1離心15 min,取血清檢測肝功能指標ALT、AST和ALP,測定方法參照試劑盒說明書。

1.4 肝組織病理學檢查取各組大鼠肝臟部分左葉,10%甲醛中固定,常規(guī)脫水,經(jīng)石蠟包埋后切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察肝組織的形態(tài)學變化,并結合血清學指標判斷纖維化程度。

1.5 TLR4m RNA表達檢測采用Trizol法提取肝臟組織總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,利用260和280 nm處的吸光度(A)值計算RNA水平。將1μg RNA反轉錄成cDNA,以sence 5′-CCAGAGCCGTTGGTGTATC-3′和antisence 5′-GCCCTGTGAGGTCGTTGA-3′為TLR4引物,以sence 5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3′和antisence 5′-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3′為β-actin引物進行擴增。反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,主循環(huán)30個;72℃終延伸5 min。取10μL PCR產(chǎn)物, 經(jīng)1%瓊脂糖電泳,以各自TLR4與β-actin A值比值作為TLR4m RNA的相對表達水平。

1.6 TLR4蛋白表達檢測選取約100 mg肝臟組織放于無菌EP管中,加入100μL RIPA裂解液,用組織破碎儀粉碎3次,冰上放置1 h,4℃、12 000 r·min－1離心5 min,提取上清液。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。灌膠上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,上層膠80 V恒壓、下層膠160 V恒壓電泳,根據(jù)標準Marker移動情況適時終止電泳。300 m A、濕轉2 h將蛋白轉移至醋酸纖維素膜上。轉膜結束后,TBST洗膜3次,每次10 min,5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜,加入TLR4多克隆抗體(1∶800)孵育,室溫雜交2 h(或4℃過夜),洗膜。加羊抗兔IgG(1∶3 000)孵育,室溫雜交2 h。洗膜,然后加ECL顯色液,上機檢測。以各自TLR4與β-actin A值比值作為TLR4蛋白的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學處理。各組大鼠血清ALT、AST和ALP活性以及TLR4m RNA和蛋白表達水平以±s表示,各檢測指標的組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能變化本實驗依據(jù)課題組前期的研究結果,檢測給藥28 d后各組大鼠的肝功能指標,結果顯示:中和高劑量LMCTS組大鼠血清中ALT、AST和ALP活性均低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)。與低劑量LMCTS組比較,中劑量LMCTS組ALP活性降低明顯(P＜0.05),而ALT和AST活性降低不明顯(P＞0.05)。與中劑量LMCTS組比較,高劑量LMCTS組ALT、AST和ALP活性均明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST和ALP活性Tab.1 Activities of serum ALT,AST and ALP of rats in various groups [n＝12,±s,λB/(U·L－1)]

表1 各組大鼠血清ALT、AST和ALP活性Tab.1 Activities of serum ALT,AST and ALP of rats in various groups [n＝12,±s,λB/(U·L－1)]

?P＜0.01 vs blank control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs model group;＃P＜0.05 vs 50 mg·kg－1LMCTS group;▲P＜0.05 vs 100 mg·kg－1LMCTS group.

Group ALT AST ALP Blank control 19.67±3.13 39.24±2.74 18.69±1.53 Model 62.62±2.65?68.66±4.73?44.87±2.59?DG 34.47±4.51△△47.14±2.55△△25.62±2.51△LMCTS(mg·kg－1) 50 53.53±4.16△62.68±2.52 38.45±1.88△100 46.21±5.69△56.81±3.61△30.32±2.32△△＃150 25.34±3.07△△?！?5.58±4.93△△?！?4.77±2.68△△?！?/p>

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學改變空白對照組大鼠肝組織中肝小葉結構完整,肝細胞排列整齊,肝板呈條索狀,且以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組大鼠肝組織中炎癥細胞浸潤明顯,并伴有大量的肝細胞水樣變、氣球樣變和脂肪樣變性;匯管區(qū)纖維組織明顯增生,并伸入小葉將肝小葉分割。DG組大鼠肝組織炎性浸潤不明顯,肝小葉完整,肝細胞排列趨于整齊;細胞未見水樣變或脂肪樣變;細胞核大而清晰。低劑量LMCTS組大鼠肝組織炎癥明顯,肝小葉結構相對完整,但肝細胞排列紊亂;部分肝細胞呈水樣變或脂肪樣變性;細胞核大小不一。中劑量LMCTS組大鼠肝組織局部有炎癥浸潤,但肝小葉結構破壞不明顯,肝細胞排列不整齊,偶見肝細胞水樣變或脂肪樣變性。高劑量LMCTS組大鼠肝組織炎性浸潤不明顯,肝小葉結構正常,肝細胞排列整齊、肝細胞水樣變少見。與模型組大鼠比較,不同劑量LMCTS組和DG組大鼠肝組織中炎性細胞浸潤及膠原纖維增生較少,肝小葉破壞明顯減輕,其中以高劑量LMCTS組大鼠效果最好。見圖1(插頁五)。

2.3 各組大鼠肝組織中TLR4mRNA表達RT-PCR法檢測結果顯示:與空白對照組比較,模型組大鼠肝組織中TLR4mRNA表達水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,中和高劑量LMCTS組TLR4m RNA表達水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),其中高劑量LMCTS組降低最為明顯;不同劑量LMCTS組之間比較差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2和圖2。

表2 各組大鼠肝組織中TLR4mRNA表達水平Tab.2 Expression levels of TLR4m RNA in liver tissue of rats in various groups(n＝12,±s)

表2 各組大鼠肝組織中TLR4mRNA表達水平Tab.2 Expression levels of TLR4m RNA in liver tissue of rats in various groups(n＝12,±s)

?P＜0.01 vs blank control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs model group;＃P＜0.05 vs 50 mg·kg－1LMCTS group;▲P＜0.05 vs 100 mg·kg－1LMCTS group.

Group TLR4m RNA Blank control 0.22±0.03 Model 1.13±0.14?DG 0.32±0.04△△＃LMCTS(mg·kg－1) 50 1.09±0.09 100 0.67±0.11△＃150 0.34±0.06△△?！?/p>

2.4 各組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達Western blotting結果顯示:與空白對照組比較,模型組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,中和高劑量LMCTS組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達水平均降低(P＜0.05 或P＜0.01),其中高劑量LMCTS組降低最為明顯。不同劑量LMCTS組之間比較差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3和圖3。

圖2 各組大鼠肝組織中TLR4m RNA表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of TLR4m RNA in liver tissue of rats in various groupsM:Marker;Lane 1:Blank control group;Lane 2:Model group; Lane 3:DG group;Lane 4－6:50,100,and 150 mg·kg－1LMCTS groups.

表3 各組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of TLR4protein in liver tissue of rats in various groups(n＝12,±s)

表3 各組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of TLR4protein in liver tissue of rats in various groups(n＝12,±s)

?P＜0.01 vs blank control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs model group;＃P＜0.05 vs 50 mg·kg－1LMCTS group;▲P＜0.05 vs 100 mg·kg－1LMCTS group.

Group TLR4protein Blank control 0.13±0.01 Model 1.67±0.12?DG 0.31±0.05△△LMCTS(mg·kg－1) 50 1.52±0.07 100 1.00±0.24△＃150 0.28±0.05△△＃▲

圖3 各組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of TLR4protein in liver tissue of rats in various groupsLane 1:Blank control group;Lane 2:Model group:Lane 3:DG group;Lane 4－6:50,100,and 150 mg·kg－1LMCTS group.

3 討論

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內結締組織的異常增生,是各種慢性肝病的共同病理表現(xiàn)。肝纖維化和肝硬化是連續(xù)的發(fā)展過程,其早期診斷及治療對肝硬化的防治和逆轉均具有重要意義[12]。血清學指標是反映肝實質損害及病變的最敏感指標,而肝臟組織學檢查可以直觀和準確地判斷肝病嚴重程度[13-14]。本實驗利用CCl4制備大鼠肝纖維化模型,通過血清學和組織病理學檢測證明了LMCTS可不同程度地改善肝臟功能,修復大鼠的肝纖維化,其作用效果與DG相當,這為開發(fā)新型高效無不良反應的修復肝損傷的天然候選藥物提供了實驗依據(jù)。

LPS也稱內毒素(endotoxin),是肝損傷中的一個重要因子,能刺激機體產(chǎn)生強烈的炎癥反應[15]。作為LPS的模式識別受體TLR4可表達在機體多種細胞,如單核細胞、內皮細胞等細胞表面,LPS與TLR4結合后可激活核轉錄因子-κB,導致許多促炎因子的產(chǎn)生[16-18]。因此,LPS與TLR4的相互作用在肝纖維化的發(fā)病機制中起到了關鍵性作用。王登妮等[19]研究發(fā)現(xiàn):在肝纖維化過程中,TLR4表達水平明顯升高;而Bai等[20]研究發(fā)現(xiàn):百里香醌可通過抑制TLR4信號通路介導的炎性反應發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究發(fā)現(xiàn):肝纖維化大鼠肝組織中的TLR4mRNA和蛋白表達水平明顯升高,與上述報道結果一致;而中和高劑量LMCTS可不同程度地降低肝組織中TLR4表達水平,其中以高劑量LMCTS組的效果最為明顯,這與LMCTS改善肝臟功能和修復大鼠的肝纖維化的結果相一致。提示LMCTS對大鼠肝纖維化的抑制作用很可能與TLR4表達有關,其具體的信號傳導過程有待進一步證實。

綜上所述,本研究不僅發(fā)現(xiàn)了LMCTS具有修復肝損傷作用,而且還初步證明了一個相關作用的靶點,這為充分利用殼聚糖資源、研究其修復肝損傷的機制、開發(fā)無不良反應的天然抑制肝纖維化的候選藥物奠定了基礎。

[注:本文由第一、第二作者共同完成]

[1]Radbill BD,Gupta R,Ramirez MC,et al.Loss of matrix metalloproteinase-2 amplifies murine toxin-induced liver fibrosis by upregulating collagen I expression[J].Dig Dis Sic, 2011,56(2):406-416.

[2]Huang Y,Huang C,Li J.Effect of cytokines secreted from Kupffer cell on HSC proliferation,apoptosis in hepatic fibrosis process[J].China Pharmacol Bull,2010,26(1):9-13.

[3]陸倫根,李鄭紅.肝纖維化及肝硬化研究近況[J].臨床肝膽病雜志,2013,29(5):321-323.

[4]Akira S,Uematsu S,Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell,2006,124(4):783-780.

[5]Beutler BA.TLRs and innate immunity[J].Blood,2009, 113(7):1399-1407.

[6]Seki E,De Minicis S,Osterreicher CH,et al.TLR4enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis[J].Nature Med,2007,13(11):1324-1332.

[7]陳 偉,陳惠英,張 彥.殼聚糖在醫(yī)藥領域的應用[J].醫(yī)學信息,2007,20(3):507-508.

[8]蔣挺大.殼聚糖[M].北京:化學工業(yè)出版社,2007:1-15.

[9]鄺勝利,胡 兵.肝纖維化大鼠模型研究進展[J].實驗動物與比較醫(yī)學,2008,28(1):62-66.

[10]Santhosh S,Sini TK,Anandan R,et al.Hepatoprotective activity of chitosan against isoniazid and rifampicin-induced toxicity in experimental rats[J].Eur J Pharmacol,2007, 572(1):69-73.

[11]敬海峰.低分子殼聚糖對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化干預作用[D].長春:吉林大學,2013.

[12]李 娜.現(xiàn)代醫(yī)學對肝纖維化防治的研究進展[J].西南軍醫(yī),2013,15(2):154-156.

[13]朱明慧,劉旭華,韓際奧,等.人臍帶間充質干細胞治療失代償期肝硬化的療效觀察[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版, 2013,48(1):117-120.

[14]張 麗.無創(chuàng)性肝纖維化診斷和評估的文獻綜述[J].中國醫(yī)藥指南,2010,8(13):40.

[15]Zou Y,Yang Y,Li J,et al.Prevention of hepatic injury by a traditional Chinese formulation,BJ-JN,in mice treated with Bacille-Calmette-Guérin and lipopolysaccharide[J].J Ethnopharmacol,2006,107(3):442-448.

[16]殷小磊,盧偉娜.LPS/TLR4信號途徑在非酒精性脂肪性肝病中的作用[J].世界華人消化雜志,2013,21(28): 2957-2962.

[17]潘 澎,劉紹能.PI3K/Akt信號通路與肝纖維化[J].臨床肝膽病雜志,2013,29(5):389-392,396.

[18]Akira S,Takeda K.Toll-like receptor signalling[J].Nat Rev Immunol,2004,4(7):499-51.

[19]王登妮,徐軍全.肝纖維化過程中Toll樣受體4在肝臟的表達分布及意義[J].中國比較醫(yī)學雜志,2010,20(6):17-20.

[20]Bai T,Yang Y,Wu YL,et al.Thymoquinone alleviates inflammation-associated liver fibrosis via TLR4signaling pathway[J].Chin J Tradition Chin Med,2013,28(5): 1541-1547.

Anti-hepatic fibrosis effect of low molecular weight chitosan and its influence in TLR4expression

MA Jia-nan1,JING Hai-feng2,ZHANG Chun-mei1,DONG You-jie1,HE Hai-tao1,HAN Xu1,FEI Rui1
(1.Department of Cell Biology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021, China;2.Experimental Teaching Center of Basic Medicine,School of Basic Medical Sciences, Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo clarify the inhibitory effect of low molecular weight chitosan(LMCTS)on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCl4)in the rats,and to investigate its effect on the expression of Toll-like receptor-4(TLR4)and to lay the foundation for the development of the clinical candidate drug of liver fibrosis.Methods72 male Wistar rats were randomly divided into blank control group,CCl4group(model group), glycyrrhizinate(DG)group,50,100 and 150 mg·kg－1LMCTS groups(low,middle and high doses of LMCTS groups).In addition to blank control group,the rats in the remaining groups were given 40%CCl4-vegetable oil (1.75 m L·kg－1),2 times per week for 8 weeks,by intraperitoneal injection to establish the model of rat hepaticfibrosis.And the rats in blank control group were injected with the same amount of 100%vegetable oil agent.From the ninth week,the rats in DG and LMCTS groups were given DG and LMCTS by intragastric administration,1 time/week for 4 weeks.Then all rats were sacrificed,the activities of serum glutamic acid aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase(AST)and alkaline phosphatase(ALP)were detected with ELISA kit;the pathological changes in liver tissue were observed under light microscope,and the TLR4expressions were detected by RT-PCR and Western blotting method.ResultsThe serum ALT,AST and ALP activities in middle and high doses of LMCTS groups were lower than those in model group(P＜0.05).The serum ALT activity in middle dose of LMCTS group was lower than that in low dose of LMCTS group(P＜0.05),but the activities of AST and ALP had no statistically significant change(P＞0.05).There were statistically significant differences in the serum ALT, AST and ALP activities between high dose of LMCTS group and middle dose of LMCTS group(P＜0.05).There were obvious hepatocyte steatosis,inflammatory cell infiltration,collagen fiber hyperplasia and hepatic lobule damage in the rats in model group.However,all the changes in liver tissue of the rats in LMCTS group were significantly reduced,especially in high dose group.The results of RT-PCR and Western blotting method showed that the expression of TLR4was declined in LMCTS groups compared with model group(P＜0.05,P＜0.01), especially in high dose of LMCTS group,and there were statistically significant differences between different doses of LMCTS groups(P＜0.05).ConclusionHigh dose of LMCTS can decrease the serum transaminase activity of liver fibrosis rats and improve liver function,and this process may be related to declining the expression of TLR4.

low molecular weight chitosan;carbon tetrachloride;hepatic fibrosis;Toll-like receptor 4

R575.2

A

2014-02-25

吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目資助課題(20100920)

馬佳男(1992－),女,黑龍江哈爾濱市人,在讀醫(yī)學碩士,主要從事細胞生物學研究。

費 瑞(Tel:0431-85619473,E-mail:feirui＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1013-05

10.13481/j.1671-587x.20140521