丹參酮ⅡA對(duì)帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制

任 博,孫法威,張作鳳,張宇新

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,河北唐山 063000)

丹參酮ⅡA對(duì)帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制

任 博,孫法威,張作鳳,張宇新

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,河北唐山 063000)

目的:探討丹參酮ⅡA對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘發(fā)的帕金森病(PD)模型小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響,闡明其對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法:將60只C57BL/6N小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PD模型組和丹參酮ⅡA組,每組20只。PD模型組和丹參酮ⅡA小鼠采用MPTP制備PD小鼠模型,丹參酮ⅡA組制備PD模型后腹腔注射丹參酮ⅡA,觀察各組小鼠行為學(xué)表現(xiàn),采用免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印跡和免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)、整合素超家族成員Ⅰ型跨膜蛋白(cd11b)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)陽性細(xì)胞數(shù)和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:與對(duì)照組比較,PD模型組小鼠出現(xiàn)典型的PD樣癥狀;PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組減少約45%和50%,cd11b、p47-phox和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)和蛋白表達(dá)水平增加(P＜0.01)。與PD模型組比較,丹參酮ⅡA組小鼠PD樣癥狀減輕,黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01),cd11b、p47-phox和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.01),蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論:丹參酮ⅡA可在一定程度上阻抑MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的丟失,其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活、NADPH氧化酶和iNOS表達(dá)有關(guān)。

帕金森病;小膠質(zhì)細(xì)胞;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;酪氨酸羥化酶;丹參酮ⅡA;小鼠

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,在我國(guó)65歲以上人群發(fā)病率高達(dá)1%。臨床上PD以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常為主要特征,病理學(xué)方面PD以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及其他含色素的神經(jīng)元大量變性丟失和殘存的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體——路易小體(Lewy body)為特征。PD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,多種因素參與該病的發(fā)生和發(fā)展,其中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷起十分重要的作用[1]。在成熟的腦內(nèi),靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出典型的分支狀形態(tài),負(fù)責(zé)免疫監(jiān)視。當(dāng)遇到腦外傷或免疫刺激時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞易被激活,從靜息的分支狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ畹陌⒚装蜖??；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的活性物質(zhì),包括活性氧和活性氮,可直接對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損傷[2-3],產(chǎn)生活性物質(zhì)的2個(gè)主要來源是煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)[4-6]。在正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,NADPH氧化酶和iNOS均不表達(dá)或低表達(dá);但在PD患者和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的PD小鼠模型腦內(nèi),兩者均高表達(dá),參與PD的發(fā)生和發(fā)展,而在缺乏這2種酶的基因突變小鼠中,多巴胺能神經(jīng)元的減少程度均減輕[7-9]。本研究采用整合素超家族成員Ⅰ型跨膜蛋白(cd11b)和p47-phox分別標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞和NADPH氧化酶。

丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA,TanⅡA)是一種從中藥丹參中提取的主要有效成分,在多種疾病中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用[10-13]。然而,丹參酮ⅡA能否在PD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚未明確。本研究采用MPTP制備PD小鼠模型,觀察模型小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、NADPH氧化酶和iNOS的變化情況,觀察丹參酮ⅡA是否具有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用,并探討其可能的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑健康雄性C57BL/6N小鼠60只,8～12周齡,體質(zhì)量25～30 g,購于北京維通利華公司,合格證號(hào):SCXX(京)2002-2003,自由進(jìn)食飲水,室溫(25±2)℃,單籠喂養(yǎng),自然光照。MPTP(Sigma公司,美國(guó)),大鼠抗小鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)單克隆抗體(Chemicon公司,美國(guó)),兔抗小鼠cd11b多克隆抗體(武漢博士德公司),兔抗小鼠p47-phox多克隆抗體(Bioworld公司,美國(guó)),兔抗小鼠iNOS多克隆抗體(北京博奧森公司),丹參酮ⅡA[西安開來生物工程有限公司,高效液相色譜(HPLC)≥98%)],UhraSensitive SP超敏試劑盒(福州邁新公司),預(yù)染蛋白Marker(天津?yàn)蠊?。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PD模型組和丹參酮ⅡA組,每組20只。PD模型組:小鼠腹腔注射MPTP 20 mg·kg－1,生理鹽水溶解,1次·2 h－1,連續(xù)4次;丹參酮ⅡA組:除給予模型組相同的處理外,在最后一次注射MPTP 12 h后,腹腔注射丹參酮ⅡA 25 mg·kg－1(含1%二甲基亞砜的PBS溶液),每天1次,連續(xù)7 d;對(duì)照組:注射與模型組和丹參酮ⅡA組等體積的生理鹽水和含1%二甲基亞砜的PBS溶液。于每次注射藥物后觀察小鼠的行為學(xué)變化。

1.3 標(biāo)本采集分別于末次注射MPTP后第3和7天處死小鼠。小鼠麻醉后,行40 g·L－1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液常規(guī)灌注固定,迅速開顱取腦, 40 g·L－1多聚甲醛后固定48 h(4℃),石蠟包埋、切片。MPTP末次注射后3 d所取標(biāo)本用于觀察cd11b、p47-phox和iNOS的表達(dá),MPTP末次注射后7 d所取標(biāo)本用于判定PD模型是否復(fù)制成功。

1.4 免疫組織化學(xué)SP檢測(cè)每組小鼠隨機(jī)取9只行免疫組織化學(xué)SP法染色。腦組織切片常規(guī)脫蠟至水后,用TBST洗3次,每次3 min,組織抗原行水浴法熱修復(fù),3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,TBST洗3次;采用正常非免疫動(dòng)物血清室溫孵育10 min;同一組織相鄰切片分別加入大鼠抗小鼠TH單克隆抗體(1∶300)、兔抗小鼠cd11b多克隆抗體(1∶200)、兔抗小鼠p47-phox多克隆抗體(1∶200)和兔抗小鼠iNOS多克隆抗體(1∶150),4℃過夜;TBST洗3次后,加入生物素標(biāo)記的第二抗體,室溫孵育20 min,TBST洗3次,加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶,室溫孵育20 min,DAB顯色,中性樹脂膠封固,光鏡下觀察拍照。選定黑質(zhì)所在區(qū)域,采用CMIAS真彩醫(yī)學(xué)圖像免疫組織化學(xué)自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。各組每只動(dòng)物6張腦片數(shù)值相加后取平均值。

1.5 免疫熒光檢測(cè)每組小鼠隨機(jī)取5只行免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)。取腦組織切片室溫放置30 min后,用PBS洗滌3次,每次5 min,新鮮的胚胎牛血清封閉2 h,0.4%Triton PBS打孔1 h,正常非免疫動(dòng)物血清室溫孵育30 min,同一組織相鄰切片分別加入大鼠抗小鼠TH單克隆抗體(1∶300)和兔抗小鼠cd11b多克隆抗體(1∶200)一抗混合液,大鼠抗小鼠TH單克隆抗體(1∶300)和兔抗小鼠p47-phox多克隆抗體(1∶150)一抗混合液,大鼠抗小鼠TH單克隆抗體(1∶300)和兔抗小鼠iNOS多克隆抗體(1∶100)一抗混合液4℃過夜,PBS振洗3次,每次5 min,加入FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶50)和TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶50)熒光二抗混合液,37℃孵育60 min,PBS振洗3次,每次5 min,超純水振洗10 min,甘油緩沖液封片,熒光顯微鏡拍照觀察。綠色熒光為cd11b、p47-phox和iNOS表達(dá),紅色熒光為TH表達(dá),橘黃色為雙重?zé)晒鈽?biāo)記。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析每組取6只小鼠行免

疫蛋白印跡分析。小鼠麻醉后迅速取腦,分離中腦黑質(zhì)部分,置入4℃細(xì)胞裂解液中,低溫勻漿,靜置30 min,12 000×g、4℃離心15 min,取上清液,－80℃保存?zhèn)溆?。蛋白定量后加?倍體積樣本緩沖液,95℃變性5 min。蛋白上樣量為20 mg,樣品在10%SDS-PAGE凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記物為參照,依相對(duì)分子質(zhì)量大小切取條帶,相應(yīng)條帶分別加入cd11b多抗(1∶200)、p47-phox多抗(1∶150)、iNOS多抗(1∶300)和TH單抗(1∶1 000),4℃過夜,室溫孵育1 h后,TBS洗5次,每次3 min,分別加入二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔IgG,1∶500)室溫孵育1 h,TBS洗5次,每次3 min,洗滌后ECL顯色,掃描蛋白印跡條帶,行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組小鼠中腦黑質(zhì)TH、cd11b、p47-phox和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)水平以±s表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)PD模型組小鼠于MPTP第3次注射后均出現(xiàn)不同程度的震顫、豎毛、弓背和翹尾等癥狀,四肢肌張力增高,協(xié)調(diào)性差,呈尾僵過直伸狀;第4次注射后,上述表現(xiàn)愈加明顯,出現(xiàn)自發(fā)性活動(dòng)減少并進(jìn)行性加重,運(yùn)動(dòng)減緩或不能。對(duì)照組小鼠未見上述變化。丹參酮ⅡA組小鼠上述行為學(xué)癥狀明顯減輕。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)照組小鼠中腦黑質(zhì)致密部可見大量TH陽性神經(jīng)元,且分布整齊,呈條帶狀,黑質(zhì)區(qū)有少量cd11b、p47-phox和iNOS陽性細(xì)胞分布。與對(duì)照組比較,PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少(P＜0.01), cd11b、p47-phox和iNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.01)。與PD模型組小鼠比較,丹參酮ⅡA組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(P＜0.01),cd11b、p47-phox和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.01)。見圖1(插頁二)和表1。

對(duì)照組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈分支狀,細(xì)胞較小;與對(duì)照組比較,PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞體積明顯增大,胞漿內(nèi)容物增多,為典型的激活態(tài)表現(xiàn);與PD模型組比較,丹參酮ⅡA組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞體積明顯縮小,胞漿內(nèi)容物明顯減少。見圖2(插頁二)。

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH免疫陽性細(xì)胞呈紅色,呈條帶狀分布; p47-phox和iNOS免疫陽性細(xì)胞呈綠色,融合圖像可見橘黃色熒光(圖3,見插頁二),提示黑質(zhì)區(qū)NADPH氧化酶和iNOS可表達(dá)于TH免疫陽性細(xì)胞。

2.3 免疫印跡分析在預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量約48 000、61 000、130 000和165 000處分別可見p47-phox、TH、iNOS和cd11b特異性蛋白條帶(圖4)。圖像分析結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較, PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)p47-phox、iNOS和cd11b的表達(dá)水平升高(P＜0.01),TH表達(dá)水平降低(P＜0.01);與PD模型組比較,丹參酮ⅡA組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)p47-phox、iNOS和cd11b表達(dá)水平降低(P＜0.01),TH水平升高(P＜0.01)。見表2。

表1 各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、cd11b、p47-phox和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)Tab.1 Number of TH,cd11b,p47-phox and iNOS positive cells in substantia nigra of mice in various groups (n＝9,±s)

表1 各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、cd11b、p47-phox和iNOS陽性細(xì)胞數(shù)Tab.1 Number of TH,cd11b,p47-phox and iNOS positive cells in substantia nigra of mice in various groups (n＝9,±s)

?P＜0.01 vs control group;△P＜0.01 vs model group.

Group Number of positie cells TH cd11b p47-phox iNOS Control 173.59±5.60 3.11±0.78 30.40±6.06 47.46±4.60 Model 82.60±35.45?12.33±1.00?101.45±48.12?88.17±27.45?TanⅡA 115.09±23.78△4.89±1.16△76.61±25.56△69.96±16.28△

圖4 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、cd11b、p47-phox和iNOS蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of TH,cd11b,p47-phox and iNOS proteins in substantia nigra of mouse midbrain in various groups detected by Western blotting methodLane 1:Control group;Lane 2:Model group;Lane 3:TanⅡA group.

3 討論

PD以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)步態(tài)異常等為主要臨床表現(xiàn),以中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性和丟失為主要神經(jīng)病理學(xué)特征。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的動(dòng)物模型具有典型的PD樣行為學(xué)表現(xiàn),中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)記物TH免疫陽性細(xì)胞明顯減少,中腦黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)下降,提示本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物中腦黑質(zhì)存在多巴胺能神經(jīng)元大量丟失;因紋狀體接受從黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元投射來的神經(jīng)纖維,故本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠紋狀體TH免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:PD模型組小鼠紋狀體的TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,并與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失相一致。上述結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物模型符合實(shí)驗(yàn)要求。本研究中丹參酮ⅡA組小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量均比模型組明顯增加,表明丹參酮ⅡA具有保護(hù)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的作用。

表2 各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、cd11b、p47-phox和iNOS蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of TH,cd11b,p47-phox and iNOS in substantia nigra of mouse midbrain in various groups (n＝6,±s)

表2 各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、cd11b、p47-phox和iNOS蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of TH,cd11b,p47-phox and iNOS in substantia nigra of mouse midbrain in various groups (n＝6,±s)

?P＜0.01 vs control group;△P＜0.01 vs model group.

Group Expression level of protein TH cd11b p47-phox iNOS Control 16.60±0.82 1.10±0.20 4.60±0.30 4.30±0.35 Model 9.57±4.37?18.30±4.30?14.58±8.20?14.46±5.37?TanⅡA 11.24±3.13△3.20±1.20△9.93±3.73△10.19±4.61△

流行病學(xué)研究[14]顯示:炎癥可增加PD發(fā)病率,許多PD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示炎癥可以導(dǎo)致中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元死亡[7-9]。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡結(jié)果顯示:PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)cd11b蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào),TH蛋白表達(dá)明顯下降;免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞體積區(qū)較對(duì)照組明顯增大,TH陽性神經(jīng)元明顯減少,這些結(jié)果提示PD模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)存在炎癥反應(yīng),且這種炎癥反應(yīng)可能與多巴胺能神經(jīng)元的減少有關(guān);丹參酮ⅡA干預(yù)后,小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)cd11b蛋白表達(dá)較PD模型組明顯下降,小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較模型組明顯減小,同時(shí)伴有TH蛋白水平升高,TH陽性神經(jīng)元增多,紋狀體多巴胺能神經(jīng)纖維增多,提示丹參酮ⅡA有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用,且這種作用可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活表達(dá)有關(guān)。

炎癥過程中小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)的大量產(chǎn)生會(huì)使中腦黑質(zhì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài),從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡。這些活性物質(zhì)的主要來源是NADPH氧化酶和iNOS[15]。NADPH氧化酶是由gp91-phox、p22-phox、p47-phox、p67-phox和p40-phox亞基構(gòu)成的多聚體酶,其中p47-phox、p67-phox和p40-phox是其胞漿部分,gp91-phox和p22-phox是其胞膜部分,本實(shí)驗(yàn)采用p47-phox作為該酶的標(biāo)記物進(jìn)行觀察。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)和免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)中p47-phox和iNOS的表達(dá)結(jié)果顯示:PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)p47-phox和iNOS表達(dá)較對(duì)照組明顯增多,且伴TH表達(dá)明顯減少,表明NADPH氧化酶和iNOS的大量表達(dá)可能導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元丟失;采用丹參酮ⅡA干預(yù)后,小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)p47-phox和iNOS表達(dá)較PD模型組明顯減少,同時(shí)伴有TH表達(dá)升高,表明丹參酮ⅡA有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用,且這種保護(hù)作用可能與抑制NADPH氧化酶和iNOS的表達(dá)有關(guān)。

研究[16]證實(shí):小膠質(zhì)細(xì)胞來源的NADPH氧化酶和iNOS的激活表達(dá)可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡。為探討多巴胺能神經(jīng)元能否表達(dá)NADPH氧化酶和iNOS從而導(dǎo)致自身死亡,本實(shí)驗(yàn)采用p47-phox、TH和iNOS和TH熒光雙標(biāo)觀察結(jié)果顯示:PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元和p47-phox及iNOS陽性細(xì)胞存在共定位,表明多巴胺能神經(jīng)元本身可表達(dá)NADPH氧化酶和iNOS。然而,這種共定位僅占p47-phox和iNOS表達(dá)的一部分,共定位區(qū)域周圍也見p47-phox和iNOS表達(dá)的其他類型細(xì)胞。這一結(jié)果提示:在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡過程中,不僅可能存在小膠質(zhì)細(xì)胞源的NADPH氧化酶和iNOS的激活表達(dá)[16],而且多巴胺能神經(jīng)元本身亦可表達(dá)NADPH氧化酶和iNOS。

有研究[17]顯示:iNOS或NADPH氧化酶的單獨(dú)激活表達(dá)可能相對(duì)有益,甚至可能起細(xì)胞保護(hù)作用,但一旦兩者聯(lián)合表達(dá),則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)中,PD模型組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)有大量激活表達(dá)的NADPH氧化酶與iNOS,同時(shí)伴有多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失,提示小膠質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞,特別是多巴胺能神經(jīng)元自身的NADPH氧化酶和iNOS大量激活表達(dá)相互作用、相互影響,共同促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)元的丟失。丹參酮ⅡA對(duì)保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用可能與其抑制黑質(zhì)內(nèi)NADPH氧化酶和iNOS表達(dá)有關(guān)。

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Protective effect of tanshinoneⅡA on dopaminergic neurons in mouse model of Parkinson’s disease and its mechanism

REN Bo,SUN Fa-wei,ZHANG Zuo-feng,ZHANG Yu-xin
(Department of Anatomy,School of Basic Medical Sciences,Hebei United University,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo explore the effects of tanshinoneⅡA on the injury of dopaminergic neurons of Parkinson’s disease(PD)mouse model induced by 1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP),and to clarify the possible mechanism of its protective effects on dopaminergic neurons.Methods60 C57BL/6N mice were randomly divided into control group,PD model group and tanshinoneⅡA group(n＝20).The mice in PD model group and tanshinoneⅡA group were treated with MPTP to establish PD models.The bebavior of the mice in various groups was observed.The number of tyrosine hydroxylase(TH),cd11b,p47-phox,and induciblenitricoxidesynthase(iNOS)-positive cells,and the protein expression levels of TH,cd11b,p47-phox and iNOS in the substantia nigra(SN)of the midbrain of the mice in various groups were detected with immunohistochemistry, Western blotting and double-labeling immunofluorescence assay.ResultsCompared with control group,the mice in PD model group exhibited typical symptoms of PD,and the number of TH-positive cells and the protein expression level of TH in the substantia nigra of the mice in PD model group were reduced by about 45%and 50%; the number of cd11b,p47-phox,iNOS-positive cells and the protein expression levels of cd11b,p47-phox,iNOS were markedly increased(P＜0.01).Compared with PD model group,the symptoms of PD of the mice in tanshinoneⅡA group were alleviated,the number of TH-positive cells and the expression level of TH protein in the SN were increased(P＜0.01),and the number of cd11b,p47-phox and iNOS-positive cells and the TH protein expression levels were obviously decreased(P＜0.01).ConclusionTanshinoneⅡA could mitigate the loss of dopaminergic neurons in the PD mouse model induced by MPTP.The mechanism of neuprotective effect may be related to the inhibition of microglial activation,NADPH oxidase and iNOS expressions.

Parkinson’s disease;microglia;NADPH oxidase;inducible nitric oxide synthase;tyrosine hydroxylase;tanshinoneⅡA;mice

R742.5

A

2013-12-02

河北省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(C2004000689);河北省科技廳博士基金資助課題(05547008D-4);河北省科技廳科學(xué)技術(shù)與社會(huì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(04276135)

任 博(1987－),男,山東省濟(jì)南市人,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事帕金森病病因與發(fā)病機(jī)制的研究。

張宇新(Tel:0315-3726421,E-mail:jpzyx＠163.com)

時(shí)間: 2014-08-27 14:42

網(wǎng)絡(luò)出版地址: www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1442.003.html

1671-587Ⅹ(2014)05-0947-06

10.13481/j.1671-587x.20140508