高效偶氮染料降解菌處理毛皮染色廢水的研究

馬宏瑞， 張兆鑫， 羅羿超， 朱 超

(1.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.普士頓興業(yè)有限公司, 臺灣 臺南 71043)

0 引言

毛皮染色廢水是一類成分復(fù)雜(含有不同種類的偶氮染料、蒽醌染料等)、高色度、高鹽度、難降解的工業(yè)廢水[1],因此導(dǎo)致經(jīng)現(xiàn)有處理工藝處理后廢水的各項指標(biāo)很難達到直排中的一級排放標(biāo)準(zhǔn)(GB 30486-2013).

目前,工業(yè)廢水的常規(guī)生化處理工藝有直接好氧、厭氧-好氧結(jié)合等方法[2,3].針對染色廢水的處理，常用的生物法如活性污泥法等處理后的廢水所能達到的處理效果并不理想，雖然其對BOD去除效果明顯(一般可達80%左右),但對COD和色度的去除率卻不高[4].因此，在生物處理中尋找一種對廢水COD和色度有著良好去除效果的方法很有必要.

生物強化技術(shù)是一種針對目標(biāo)污染物，在傳統(tǒng)生物處理系統(tǒng)中投加具有特定功能菌劑的生物處理技術(shù).近年來，采用生物強化技術(shù)處理各類廢水的研究報道屢見不鮮，但多是針對單一模擬染料廢水的處理[5]，而針對具體的毛皮染色廢水處理的研究甚少.Sharma等[6]從印染廠廢水溝渠及處理裝置中分離出5株高效菌，經(jīng)混合培養(yǎng)并固定化后投加到反應(yīng)器中,發(fā)現(xiàn)其對三苯甲烷染料酸性藍15的脫色率達到94 %；何芳等[7]的研究表明，當(dāng)高效菌與活性污泥混合接種后，對印染廢水COD、色度的去除率分別高于85%和75%，出水水質(zhì)穩(wěn)定，同時對溫度、pH的適應(yīng)范圍較寬，微生物脫色活性高.采用強化菌劑投加法進行廢水脫色處理，是目前的研究熱點.

本研究進行了高效偶氮染料脫色降解菌株的篩選分離和復(fù)合菌劑的制備，并采用直投法對毛皮染色廢水進行了處理，監(jiān)測了處理過程中廢水水質(zhì)的變化情況，評估了其處理效果，可為毛皮染色廢水的高效處理提供技術(shù)支持.

1 材料和儀器

1.1 供試材料

試驗所用6株細菌從降解偶氮染料的厭氧污泥中分離純化所得[8]，將其編號為菌a、b、c、d、e、f.將6株細菌復(fù)壯后涂布在含偶氮染料LB固體培養(yǎng)基上，作為接種純培養(yǎng)物.

活性污泥取自西安市第五污水處理廠曝氣階段的好氧活性污泥.該廠主要處理生產(chǎn)廢水及生活污水，出水水質(zhì)執(zhí)行《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002)中的一級B類標(biāo)準(zhǔn).

本試驗所用毛皮染色廢水取自浙江某毛皮廠，表1為其經(jīng)過脫鉻后的出水水質(zhì).

表1 毛皮染色廢水的理化特性

1.2 主要儀器

420-BS型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博泰)；HC-3018R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳)；PHC-3C型雷磁pH儀(上海精科)；RH-QG型全溫光照振蕩器(金壇市金南儀器)；HS-1300-V型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；T-gradient型PCR儀(美國ABI)；Gel-Doc2000型凝膠成像儀(英國Syngene).

2 試驗方法

2.1 微生物菌液的制備

從固體培養(yǎng)基挑取細菌并接種至10 mL液體LB培養(yǎng)基中，120 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)8～10 h，此時微生物處于對數(shù)生長期，將此菌液4 ℃保存，以供投加使用.

2.2 微生物菌液對廢水的處理

2.2.1 單株菌液對廢水的處理

將150 mL廢水加入三角瓶中并加入單株菌液，菌液添加量為廢水體積的5%和10%，120 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)120 h，每24 h取樣，測定廢水的色度，并用孔徑為0.22 nm的濾膜過濾樣品測定濾液CODCr.

2.2.2 混合菌液對廢水的處理

將150 mL廢水加入三角瓶中并加入混合菌液，設(shè)定4個菌液添加水平(1%、2%、5%、10%)，并在5%的投加量下改變反應(yīng)條件(是否外加碳、氮源，是否曝氣，改變廢水的pH).120 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)120 h，每24 h取樣，并用孔徑為0.22 nm的濾膜過濾后測定濾液CODCr.

2.3 菌液強化污泥對廢水的處理

將培養(yǎng)一周的活性污泥樣品放置在有效容積為5 L的聚乙烯容器內(nèi)進行好氧曝氣培養(yǎng)，初始MLSS為5 000 mg/L.向活性污泥中加入廢水并加入混合菌液，泥水比為1∶1.設(shè)計L9(34)的正交試驗，試驗中各項因素水平見表2所示.在保持溶解氧(DO)濃度約2 mg/L和25 ℃恒溫條件下，連續(xù)培養(yǎng)48 h，分別在培養(yǎng)期的1 h，2 h，4h，6 h，8 h，12 h，24 h，48h等，取上清液測CODCr.

表2 正交試驗因素水平

注：1.菌液投加時間為試驗的0 h、12 h.水平1為0 h時1次投加，水平2為0 h、12 h時2次投加，水平3為12 h時1次投加.2.外加碳、氮源以COD=1 000 mg/L為基準(zhǔn).

CODCr的測定采用HJ/T399-2007法，色度的測定采用稀釋倍數(shù)法，pH的測定采用儀器快速測定.

2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

為驗證菌劑在處理過程中組成菌的存活情況，我們對直投法處理后的染料廢水中進行平板分離，之后再對優(yōu)勢菌株進行基因組DNA提取(康為世紀，北京)，使用細菌通用引物對27F/1492R進行16S rRNA基因的擴增.

PCR體系為(25μL)：模版1μL，混合液12.5μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，無菌水9.5μL ddH2O，引物 (27F/1492R)各1μL.

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)25次；72 ℃延伸1 min.

采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對擴增片段進行回收，在瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的大小后，將其TA克隆并測序，將測序后的16S rRNA基因序列結(jié)果與GenBank上的相關(guān)16S rRNA基因序列進行相似性比對分析[9,10].

3 結(jié)果與討論

3.1 微生物菌液對廢水的處理效果

3.1.1 單株菌液對廢水的處理效果

圖1顯示了在不同投加量下添加單株菌液后廢水COD的變化趨勢.從圖1可以看出，在添加菌液之后，廢水的COD均有一定程度地下降.但值得注意的是，剛添加入菌液后的廢水COD會上升，這可能是由于細菌剛進入新環(huán)境還需要適應(yīng)，并未立即開始環(huán)境基質(zhì)代謝而造成[11].總體來說，菌液投加量為5%時廢水的COD可以降低至600 mg/L左右，其降低程度要好于投加量為10%的情況;在5%的投加量下,菌c和e兩種菌的菌液對廢水COD去除效果最好，其去除率均達到了50%左右.

(a)菌液添加量為5%

(b)菌液添加量為10%圖1 不同添加量下添加單株菌液 后廢水COD的變化

表3為投加量5%時單株菌液對廢水色度的去除效果.可以明顯看出，對COD去除效果較好的菌c和e，卻是對色度去除最差的兩株菌；而菌d雖不能很好地去除COD，但其對色度的去除率能達到80%.由以上試驗可以看出，單株菌液并不能很好地起到既去除廢水COD，又能去除廢水色度的作用.因此，之后試驗采用混合菌液對廢水進行處理.

表3 單株菌液對廢水色度的去除效果

3.1.2 混合菌液對廢水的處理效果

混合菌液在不同狀態(tài)下對廢水COD的去除效果如圖2所示.從圖2(a)可以看出，混合菌液投加量的不同對廢水COD的去除效果也不同.在5%這個投加量下,微生物菌液處理廢水的效果最好，其對廢水COD的去除率高于其它三個投加量.這是因為菌液投加量過低會造成廢水中所含有的有效細菌數(shù)目過少，而少量的細菌并不能完全地利用廢水，從而導(dǎo)致其對廢水COD的去除效果不好.而在10%這個投加量下，由于廢水中細菌的數(shù)目過多，導(dǎo)致細菌在利用廢水生長的同時分泌出了一定量的代謝產(chǎn)物，造成廢水COD降低的效果不好.

圖2(b)顯示的是在廢水初始pH不同下，菌液對廢水COD的去除效果.可以明顯看出，在調(diào)節(jié)廢水pH之后加入菌液時，當(dāng)在pH=5的條件下對廢水的處理效果最好；而在pH=7這個偏中性的環(huán)境下廢水COD的降低效果并不好；在pH=9、11環(huán)境下的處理效果更差.由于組成復(fù)合菌劑的菌株是從降解染料的厭氧污泥中分離出來的，在酸性條件下生長更好，所以pH=5時處理效果好，再往上增加會導(dǎo)致微生物生長不利，從而使得處理效果不佳，COD去除有限[12].

圖2(c)是在5%投加量下，通過改變反應(yīng)條件的廢水COD去除效果圖.可以看出，無論是曝氣還是對廢水中外加碳源，其對廢水COD降低的影響并不大；而對廢水外加氮源，則能有效促進廢水COD的去除.通過對廢水理化性質(zhì)觀察可以發(fā)現(xiàn)，該毛皮染色廢水的NH4+-N較低，而正常的微生物體內(nèi)的碳氮比是5∶1[13]，這造成細菌在消耗廢水中的C的同時可能無法消耗需要的N，從而導(dǎo)致細菌的生長并不是在一個最合適的碳、氮源條件下，因此對廢水的去除效果也就不理想[14].

(a)不同混合菌液投加量

(b)菌液投加量為5%，不同廢水起始pH值

(c)菌液投加量為5%，不同反應(yīng)條件圖2 不同狀態(tài)下添加混合 菌液廢水COD的變化

從上述試驗結(jié)果看出，菌液在5%投加量下，廢水初始pH=5，同時在廢水中外加一定量的氮源，會對廢水COD的去除起到很好的效果.只加入菌液的廢水COD最低能降到500 mg/L左右，無法達到理想的效果，因此，宜將菌液投加入活性污泥中，使其混合，再對廢水進行處理.

3.2 菌液與污泥混合對廢水的處理效果

表4為菌液與污泥混合處理毛皮染色廢水的正交試驗結(jié)果.可以看出，Ri的排序為13.666>6.333>5>3.667，添加投加量對菌液處理廢水的效果影響比較顯著，進水pH對其處理效果影響最小.

表4 L9(34)正交試驗結(jié)果

由正交試驗結(jié)果可知，本試驗最優(yōu)組合為投加量5%(V/V)，0 h一次投加，外加營養(yǎng)物質(zhì)C/N為5∶1，進水pH為5，其對廢水的COD去除率可以達到90%以上.

由于添加了微生物菌液，在大多數(shù)試驗組中廢水COD去除率都達到了80%以上，而傳統(tǒng)生化方式對廢水COD的去除率最好也就達到80%，很難達到90%以上.因此，投加混合菌液對廢水COD的去除具有積極效果.

3.3 復(fù)合菌劑的生物穩(wěn)定性

通過對直投法處理液中的菌種進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌株和組成復(fù)合菌劑的菌株基本一致,見表5所示.說明在處理毛皮染色廢水過程中,復(fù)合菌劑的生物性能穩(wěn)定.這可能是因為復(fù)合菌劑的構(gòu)成菌株通過共代謝穩(wěn)定存在于廢水的處理過程中.

實驗表明，在廢水處理中，假單胞菌屬能較好地利用葡萄糖并產(chǎn)生乙酸等物質(zhì)[15]；副球菌屬是一類兼性厭氧的細菌，在好氧環(huán)境下扮演硝化細菌的角色，而在厭氧環(huán)境下卻能促進反硝化作用，能夠快速利用廢水中的小分子有機酸進行生長[16]；復(fù)合菌劑中的寡養(yǎng)單胞菌具有獨特的代謝活性，對于有機高分子和有機鹽均有很高的利用度[17]，已有研究表明其對60 mg/L結(jié)晶紫溶液的脫色率達95.7%[18].從降解染色廢水環(huán)境中,分離并篩選出幾種對于染色廢水具有高效降解效果的微生物,將是今后重點研究的方向之一.

表5 菌種鑒定結(jié)果：同源菌種及相似度

4 結(jié)論

從降解偶氮染料的厭氧污泥中分離純化出6種微生物，再將微生物制備成為菌液，之后將其投加到毛皮染色廢水中.試驗結(jié)果表明：

(1)單株菌液對廢水COD的去除效果存在差別.對廢水COD去除效果較好的菌株，其對廢水色度的去除效果不好.

(2)混合菌液對廢水的處理效果表明，菌液投加量、廢水初始pH、是否外加營養(yǎng)物質(zhì)等對廢水的COD去除具有一定的影響.

(3)向活性污泥中加入微生物菌液后，當(dāng)菌液投加量5%(V/V)，0h一次投加，外加營養(yǎng)物質(zhì)C/N為5∶1，進水pH為5時，其對廢水COD的去除率可以達到90%以上.與普通生化法處理廢水相比，其處理效果更好.

(4)通過對直投法處理液中的菌種進行分離鑒定，可以證實處理液中優(yōu)勢菌株和組成復(fù)合菌劑的菌株一致.說明在處理毛皮染色廢水過程中，復(fù)合菌劑的生物性能穩(wěn)定.

[1] 孫凌凌,俞從正,馬興元.印染廢水處理技術(shù)在皮革染色廢水中的應(yīng)用[J].皮革科學(xué)與工程,2009,19(5)∶49-53.

[2] 彭躍蓮,韓燕劭,李建中.生物技術(shù)在印染和染料廢水處理中的應(yīng)用[J].環(huán)境科學(xué)進展,1997,5(3):57-64.

[3] 程國鋒,李順鵬.厭氧生物處理在印染廢水處理中的應(yīng)用[J].中國沼氣,1997,15(1):3-6.

[4] 侯晨雯,俞從正,馬興元.用于皮革染色廢水處理的改良型ABR的啟動研究[J].中國皮革,2011,40(1):33-36.

[5] 梁 威,胡洪營.印染廢水生物強化處理技術(shù)研究進展[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2004,5(1):8-11.

[6]SharmaD.K.Biodegradationofacidblue15,atextiledye,byanupflowimmobilizedcellbioreactor[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2004,31(3):109-114.

[7] 何 芳,侯翠榮,黃海東,等.固定化高效混合菌好氧處理印染廢水的研究[J].中國給水排水,2006,22(9):78-81.

[8] 解井坤,朱 超,花 莉.脫水污泥中脫色偶氮染料功能菌群的馴化分離[J].微生物學(xué)通報,2014,41(12):58-63.

[9]KimS.B,YoonJ.H,KimH,etal.AphylogeneticanalysisofthegenusSaccharomonosporaconductedwith16SrRNAgenesequences[J].InternationalJournalofSystematicBacteriology,1995,45:351-356.

[10]RaineyF.A,WardRaineyN,KroppenstedtR.M,etal.ThegenusNocardiopsisrepresentsaphylogeneticallycoherenttaxonandadistinctactinomycetelineage:proposalofNocardiopsiaceaefam.nov[J].InternationalJournalofSystematicBacteriology,1996,46:28-96.

[11]KimI.S,EkpeghereK.I,HaS.Y,etal.Full-scalebiologicaltreatmentoftannerywastewaterusingthenovelmicrobialconsortiumBM-S-1[J].JournaofEnvironmentalScience&Health,2014,49:355-364.

[12]ChunJ,KimK.Y.,LeeJ.H.,etal.Theanalysisoforalmicrobialcommunitiesofwild-typeandtoll-likereceptor2-deficientmiceusinga454GSFLXtitaniumpyrosequencer[J].BMCMicrobiol,2010,10:101-105.

[13]JosepA.T,JuanA.B,JulianC.Denitritationofahigh-strengthnitritewastewaterinasequencingbatchreactorusingdifferentorganiccarbonsources[J]ChemicalEngineeringJournal,2011,172:994-998.

[14]ObajaD,MaceS,MataAlvarezJ.Biologicalnutrientremovalbyasequencingbatchreactor(SBR)usinganinternalorganiccarbonsourceindigestedpiggerywastewater[J].BioresourceTechnology,2005,96(1):7-14.

[15]TelkeA.A,KalyaniD.C,DawkarV.V,et,al.InfluenceoforganicandinorganiccomoundsonoxidoreductivedecolorizationofsulfonatedazodyeC.I.reactiveorange16[J].JHazardMater,2009,172(1):289-309.

[16] 楊 航,黃 鈞,劉 博.異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌ParacoccuspantotuophusATCC35512的研究進展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2008,14(4):585-592.

[17]KaparullinaE,DoroninaN,ChistyakovaT,etal.Stenotrophomonaschelatiphagasp.nov.,anewaerobicEDTA-degradingbacterium[J].SystematicandAppliedMicrobiology,2009,32(3):157-162.

[18] 胡起靖,林玉滿,甘 莉,等.一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對結(jié)晶紫的脫色條件研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,24(2):75-79.