五步蛇咬傷致肢體腫脹與淋巴循環(huán)關(guān)系的初步研究

孫 瑤，包鵬舉，張根葆

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.蛇毒研究所；3.生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

全球每年有500萬人被毒蛇咬傷，大約10萬人死亡，近30萬人永久致殘[1]。其中，血循環(huán)毒蛇咬傷的重要并發(fā)癥就是肢體腫脹或腫脹持久不退。腫脹發(fā)展迅速，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)累及整個(gè)肢體，組織持續(xù)缺血壞死，患者不得不接受截肢的命運(yùn)，這嚴(yán)重影響患者的身心健康。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對蛇傷腫脹的認(rèn)識[2]：一是蛇毒蛋白水解酶可以直接損害血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變血管舒縮功能，增加管壁通透性；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為蛇毒作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和組織細(xì)胞，使之釋放出磷脂酶A2、組胺、5-羥色胺等，從而引起血管通透性增加，組織間液增多而腫脹；此外，還有學(xué)者認(rèn)為是蛇毒抗原抗體復(fù)合物未被清除，引起組織細(xì)胞變性所致[3]。然而目前，從腫脹消退時(shí)間和消退程度上看，西醫(yī)和中醫(yī)治療的效果并不理想。因此，深入認(rèn)識蛇傷腫脹的發(fā)病機(jī)制，積極尋求更為有效的治療方案已成為目前亟須解決的問題和研究關(guān)注的焦點(diǎn)。

作為血液循環(huán)的輔助系統(tǒng)——淋巴循環(huán)[4]，對內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起到十分重要的作用。組織液進(jìn)入毛細(xì)淋巴管[5-6]形成淋巴液，隨著集合淋巴管規(guī)律性舒縮運(yùn)動(dòng)以及胸內(nèi)負(fù)壓等作用下經(jīng)淋巴干和淋巴導(dǎo)管最終進(jìn)入血液循環(huán)的過程即為淋巴循環(huán)。通過淋巴循環(huán)可以回收組織液中的蛋白質(zhì)，運(yùn)輸脂肪及其他營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)血漿與組織液之間的液體平衡，清除進(jìn)入組織的紅細(xì)胞和細(xì)菌，發(fā)揮防御屏障的作用。蛇傷腫脹的發(fā)生發(fā)展中淋巴循環(huán)會出現(xiàn)哪些變化？至今相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)選用五步蛇毒復(fù)制蛇傷腫脹模型，觀察大鼠腸系膜淋巴管的運(yùn)動(dòng)，對乳糜池淋巴液進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，初步研究五步蛇咬傷對淋巴循環(huán)的影響，為進(jìn)一步探討蛇傷腫脹的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 清潔級Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量(220±30)g，由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號：SCXK(蘇)2009-0001。

1.2 主要試劑和儀器 皖南地區(qū)五步蛇毒，由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供；TGL-16G臺式超速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；BI 2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 五步蛇蛇傷腫脹大鼠模型 大鼠稱重后用1.5%戊巴比妥鈉溶液(2 ml/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定在大鼠手術(shù)臺上。根據(jù)Javier Mora等[7]人報(bào)道及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，于大鼠左后肢注射蛇毒溶液(0.3 mg/kg)，注射后15、30、60、120、240和480 min時(shí)測量局部腫脹度，以注射后30 min時(shí)出現(xiàn)明顯腫脹，且大鼠未死亡視為模型復(fù)制成功。

1.3.2 大鼠腸系膜集合淋巴管觀察[8]腹部手術(shù)取出腸系膜，找到1條清晰的淋巴管，置于觀察盒中，保鮮膜覆蓋其上，37 ℃保溫、保濕。利用倒置顯微鏡及錄像系統(tǒng)觀察大鼠腸系膜淋巴管30 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)變化，計(jì)算淋巴管收縮頻率。

1.3.3 大鼠乳糜池淋巴液獲取[9]肌肉注射0.5%肝素(1 ml/ kg，700 U/ ml)，全身抗凝。從劍突起沿其左側(cè)肋緣向下外方作一長約5 cm的切口，再從劍突向下作正中切開，暴露橫膈與腹主動(dòng)脈，在腹主動(dòng)脈的左后側(cè)找到乳糜池，于乳糜池上剪一斜口，將插管逆淋巴回流方向插入2～4 mm，用10號絲線將乳糜池連同周圍的結(jié)締組織、椎前筋膜一并結(jié)扎，收集模型組大鼠注射蛇毒30 min時(shí)的淋巴液。

1.3.4 毛細(xì)管電泳檢測淋巴漿[10]淋巴液置于3 000 rpm離心10 min獲取淋巴漿，將淋巴漿稀釋一倍后置于超濾管(0.5 ml，10 ku)中，14 000 rpm離心10 min，分別得到超濾液和截留蛋白并對它們進(jìn)行毛細(xì)管電泳。毛細(xì)管區(qū)帶電泳條件：石英毛細(xì)管總長60.2 cm × 75 μm i.d.(美國Beckman Coulter公司)；分離電壓：18 kV；檢測波長：198 nm；操作溫度：25 ℃；壓力方式進(jìn)樣：3.45 kPa × 5 s；30 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)。

2 結(jié)果

2.1 五步蛇蛇傷腫脹模型的評價(jià) 如圖1、2所示，以注射五步蛇毒30 min時(shí)足墊增高的厚度為100%，模型組大鼠在注射蛇毒30 min內(nèi)左后肢局部腫脹度明顯增高(P<0.05)；而在注射蛇毒30 min后，足墊增高的厚度變化不明顯，且大鼠在480 min內(nèi)未死亡，五步蛇蛇傷腫脹模型復(fù)制成功。

2.2 大鼠腸系膜集合淋巴管的運(yùn)動(dòng)頻率 40倍鏡下觀察到位于腸系膜脂肪樹中的集合淋巴管，見圖3。1 min內(nèi)淋巴管完成一次舒縮的次數(shù)即為運(yùn)動(dòng)頻率，結(jié)果見圖4，注射蛇毒30 min內(nèi)，腸系膜淋巴管的運(yùn)動(dòng)頻率呈現(xiàn)小幅度增加，可能與組織液生成增多有關(guān)。30 min后，腸系膜淋巴管運(yùn)動(dòng)頻率顯著下降(P<0.05)，提示淋巴管功能紊亂，這可能是參與蛇傷腫脹發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.3 淋巴漿毛細(xì)管電泳 同等電泳條件下，與對照組相比，模型組淋巴漿中出現(xiàn)了多種活性組分(結(jié)果見圖5、6)，它們可能是促進(jìn)蛇傷腫脹發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵物質(zhì)。

3 討論

目前對蛇傷腫脹的研究多定位在組織細(xì)胞和血管上，而其與淋巴循環(huán)的關(guān)系報(bào)道甚少。淋巴管起始于毛細(xì)淋巴管，僅由一層淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞組成，管壁薄，缺乏基底膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞通過錨絲維持內(nèi)皮細(xì)胞間的開放連接，可允許多種大分子物質(zhì)自由進(jìn)入毛細(xì)淋巴管。蛇毒[11]主要成分是蛋白質(zhì)和多肽，約占干重的95%，進(jìn)入組織中的蛇毒其中一部分隨損傷的血管進(jìn)入血液外，另一部分經(jīng)毛細(xì)淋巴管進(jìn)入淋巴循環(huán)，最終到達(dá)血液中。

由于蛇傷的部位多位于四肢肢體，故本實(shí)驗(yàn)通過注射一定量的五步蛇毒于大鼠后肢來復(fù)制蛇傷腫脹模型。當(dāng)蛇毒劑量為0.3 mg/kg時(shí)，發(fā)現(xiàn)注射后30 min時(shí)局部腫脹度明顯增高，30 min后腫脹的變化不明顯，且大鼠在480 min內(nèi)未死亡，這與臨床蛇傷腫脹的發(fā)展特征十分吻合[2]。

圖1 大鼠正常足(A)與五步蛇毒腫脹足(B)的比較

Fig 1 Comparison of normal rat foot (A) and swollen foot (B) after intervention withAgkistrodonacutusvenom

注：與NS對照組比較，#P<0.01；模型組各時(shí)間點(diǎn)的腫脹度與

30 min時(shí)的比較，aP<0.01，bP>0.05

圖3 大鼠腸系膜集合淋巴管鏡下圖

Fig 3 The microscopic appearance of mesenteric collecting lymph vessel in rats

注：與0min相比，*P<0.05，**P<0.01

圖5 對照組與模型組淋巴濾液的毛細(xì)管電泳圖譜

Fig 5 Electropherograms for lymph plasma filtrate in the control and model group

圖6 對照組與模型組淋巴截留蛋白的毛細(xì)管電泳圖譜

Fig 6 Electropherograms for lymph plasma protein retention in the control and model group

在神經(jīng)和多種活性物質(zhì)的共同參與下，集合淋巴管平滑肌節(jié)律性的舒縮維持淋巴液單向循環(huán)，這是淋巴循環(huán)的動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)[12]。為了解蛇傷腫脹時(shí)集合淋巴管功能的改變情況，在注射蛇毒后動(dòng)態(tài)檢測大鼠腸系膜集合淋巴管的運(yùn)動(dòng)頻率。結(jié)果表明，注射蛇毒30 min內(nèi)，腸系膜淋巴管的運(yùn)動(dòng)頻率呈現(xiàn)小幅度增加，這可能與腸黏膜組織液生成增多、淋巴液量增加，從而提高淋巴管舒縮運(yùn)動(dòng)有關(guān)；30 min后，腸系膜淋巴管運(yùn)動(dòng)頻率顯著下降，提示淋巴管平滑肌功能紊亂。由此可推測腫脹組織淋巴管的功能改變出現(xiàn)的更早或(和)更加嚴(yán)重，這可能是參與蛇傷腫脹發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，在注射蛇毒30 min時(shí)獲取乳糜池淋巴液，并進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。為提高檢測效率，我們將淋巴液離心后再超濾[13]，截留物多為分子量大于3 ku的蛋白，而超濾液主要是分子量小于3 ku的多肽。圖譜顯示，模型組淋巴漿中出現(xiàn)了多種活性組分，它們可能是促進(jìn)蛇傷腫脹發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵物質(zhì)。

綜上所述，本研究證實(shí)五步蛇咬傷后淋巴液中出現(xiàn)多種活性組分，淋巴管運(yùn)動(dòng)頻率降低，繼而加重肢體腫脹。至于蛇傷腫脹淋巴循環(huán)功能障礙的具體機(jī)制還需從淋巴管的細(xì)胞分子水平進(jìn)行深入探討，從而為尋找能早期緩解患者癥狀、減少并發(fā)癥、降低致殘率的蛇傷腫脹治療新方案提供理論依據(jù)。

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