馬納維諾凝膠作為候選殺微生物劑的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性體外評(píng)價(jià)

李良峰，賁銀銀，李亮助，張曉燕,2

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

據(jù)聯(lián)合國人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征計(jì)劃〔Joint United Nations Programme on human immunodeficiency virus(HIV)/acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)，UNAIDS〕的相關(guān)報(bào)道，截止2012年，全球共有3 530萬例艾滋病患者。其中2012年新發(fā)HIV感染230萬例，與2001年(340萬例)相比，降低33%[1]。目前，性傳播途徑已成為HIV最主要的傳播途徑。在中國，HIV同性之間的傳播比例越來越高。2007年HIV感染者中，同性之間傳播比例為13%，比2006年的2.5%大幅度提高[2]。近年來，殺微生物劑的研究正從無特異性作用機(jī)制的廣譜殺微生物劑慢慢向能特異性抑制HIV感染的殺微生物劑轉(zhuǎn)變，如反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(reverse transcriptase inhibitor，RTI)[3,4]。最新臨床研究表明，包含1%核苷酸類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑替諾福韋(tenofovir，TFV)的凝膠制劑經(jīng)生殖道局部使用能很好地阻止HIV通過性途徑傳播[5]。馬納維諾(maraviroc，MRV)為趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)拮抗劑，通過屏蔽輔助受體CCR5來阻止HIV進(jìn)入宿主CD4+T細(xì)胞[6,7]。馬納維諾作為口服藥物在臨床試驗(yàn)中取得了較好效果，如在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，相對(duì)于安慰劑組，聯(lián)合使用馬納維諾能顯著增加CD4+細(xì)胞數(shù)量(P<0.001)，同時(shí)還能顯著改善機(jī)體的免疫應(yīng)答[8-10]。因此，馬納維諾作為候選殺微生物劑其有效性與安全性值得探索。羥乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose，HEC)廣泛應(yīng)用于生殖道制劑中，是一種較好的凝膠制劑載體[11]。本研究將馬納維諾溶于HEC中，在體外對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其作為殺微生物劑使用提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬納維諾購自上海百誼生物科技有限公司，HEC購自美國Sigma公司，DMEM/High glucose培養(yǎng)基和改良RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Thermo公司，新生牛血清購自美國Thermo公司，噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT)試劑盒購自美國Sigma公司，熒光素酶底物購自美國Promega公司。TZM-bl、Jurkat-T細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 儀器

Synergy 2多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，Victor 3多功能酶標(biāo)儀購自德國PerkinElmer公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.3 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的安全性評(píng)價(jià)

采用TZM-bl和Jurkat-T細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)中馬納維諾濃度為100 mmol/L、10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、100 nmol/L。分為兩大組：一組馬納維諾溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，一組溶于0.015% HEC中。將細(xì)胞按1×104個(gè)/孔在96孔板中鋪板，第2天將培養(yǎng)基換成含對(duì)應(yīng)濃度馬納維諾的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；加入20 μl 15 mg/ml MTT，37 ℃、5%CO2孵育3～4 h；吸去上清液，加入200 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，在振蕩器上振蕩10 min，于490 nm處讀取光密度(optical density，OD)值。最終結(jié)果用細(xì)胞存活率來表示：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-本底OD值)/(空白對(duì)照孔OD值-本底OD值)×100%。與此同時(shí)，將各藥物濃度組、陰性對(duì)照組(不加藥物)的OD值及各藥物濃度組相對(duì)于陰性對(duì)照組被抑制的OD值輸入SPSS軟件，進(jìn)行回歸分析，選取細(xì)胞存活抑制率為10%和50%時(shí)的藥物濃度，即各種細(xì)胞90%存活和50%存活時(shí)的藥物安全濃度。

1.4 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的抗病毒活性檢測

采用96孔板，每孔加入1×104個(gè)TZM-bl細(xì)胞、100半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)的B亞型和C亞型假病毒、對(duì)應(yīng)濃度的馬納維諾和馬納維諾+HEC復(fù)合物，其中HEC最終濃度為0.015%，馬納維諾的濃度從25 nmol/L開始5倍梯度稀釋，直至0.04 nmol/L。同時(shí)設(shè)只加假病毒的陽性對(duì)照和只有細(xì)胞的陰性對(duì)照，每孔中的體系為200 μl，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。37 ℃、5% CO2孵育48 h；吸去上清液，加入25 μl細(xì)胞裂解液，振蕩器振蕩10 min；加入50 μl熒光素酶底物液，在多功能酶標(biāo)儀上讀數(shù)，用SPSS軟件計(jì)算對(duì)應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.5 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的穩(wěn)定性檢測

將馬納維諾溶于1.5% HEC中，終濃度為6 mmol/L，儲(chǔ)存于4 ℃、室溫、30 ℃和40 ℃，保持相對(duì)濕度為75%。儲(chǔ)存前先檢測復(fù)合物的抗病毒活性，然后每隔1周檢測1次，持續(xù)8周。檢測時(shí)將馬納維諾稀釋至8 nmol/L(馬納維諾對(duì)C亞型假病毒的IC90)進(jìn)行抗病毒活性檢測，采用C亞型假病毒，檢測步驟見1.4。

2 結(jié)果

2.1 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的安全性評(píng)價(jià)

如圖1所示，當(dāng)馬納維諾濃度為100 mmol/L時(shí)，不管是溶于PBS還是HEC中，TZM-bl和Jurkat-T細(xì)胞幾乎100%死亡；隨著濃度不斷降低，細(xì)胞存活率越來越高；當(dāng)濃度降至10 μmol/L時(shí)，兩種細(xì)胞的存活率接近100%。用SPSS軟件可獲得馬納維諾在PBS和HEC溶液中的IC50和IC90。對(duì)于Jurkat-T細(xì)胞，馬納維諾的IC50分別為77 μmol/L(PBS)和75 μmol/L(HEC)(P>0.05)，IC90分別為2 μmol/L(PBS)和2 μmol/L(HEC)(P>0.05)；而對(duì)于TZM-bl細(xì)胞系，馬納維諾的IC50分別為205 μmol/L(PBS)和201 μmol/L(HEC)(P>0.05)，IC90分別為17 μmol/L(PBS)和16 μmol/L(HEC)(P>0.05)。由此可見，HEC的加入并不影響馬納維諾的細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞安全性沒有明顯影響。

A: TZM-bl. B: Jurkat-T.

2.2 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的抗病毒活性檢測

采用B亞型和C亞型兩種HIV假病毒來進(jìn)行體外抗病毒活性檢測。將馬納維諾分別溶于PBS和HEC中，從25 nmol/L起5倍梯度稀釋至0.04 nmol/L。結(jié)果顯示，當(dāng)馬納維諾濃度為25 nmol/L時(shí)，不管是溶于PBS還是HEC，都幾乎100%抑制病毒感染；隨著濃度不斷降低，抑制率也不斷降低；降至0.04 nmol/L時(shí)，對(duì)假病毒感染幾乎無抑制效果(圖2)。對(duì)B亞型和C亞型假病毒，馬納維諾的IC50分別為1.383 nmol/L、1.799 nmol/L(PBS)，以及0.967 nmol/L、1.264 nmol/L(HEC)。結(jié)果提示，當(dāng)馬納維諾與HEC復(fù)合使用時(shí)，HEC不但不抑制馬納維諾的抗病毒效果，反而有輕微增強(qiáng)作用。

A: B subtype. B: C subtype.

2.3 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的穩(wěn)定性檢測

將馬納維諾溶于PBS和HEC后，分別置4 ℃、室溫、30 ℃和40 ℃，每隔1周進(jìn)行抗病毒活性檢測。如表1所示，保存前其對(duì)C亞型假病毒的抗病毒效果均在90%以上；在開始階段，抗病毒效果一直維持在90%左右；到第8周，其抗病毒效果仍處于90%以上。結(jié)果提示，馬納維諾不管是保存在PBS還是HEC中，都具有較好的穩(wěn)定性。馬納維諾在HEC中長期保存對(duì)其抗病毒活性無明顯影響。

表1 馬納維諾與HEC復(fù)合使用的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)Tab.1 Stability evaluation of combination of maraviroc and hydroxyethyl cellulose

3 討論

HIV-1融合抑制劑在HIV-1生命周期初始階段發(fā)揮作用，是較理想的候選殺微生物劑[12,13]。其在生殖道局部使用可很好地阻止HIV-1與靶細(xì)胞結(jié)合，從而抑制病毒感染[14,15]。本研究將馬納維諾與HEC混合，形成馬納維諾凝膠制劑，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行相關(guān)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，馬納維諾凝膠對(duì)B亞型和C亞型假病毒具有較好抑制效果，且HEC不但沒有抑制馬納維諾的抗病毒活性，反而在一定程度上使其活性稍微增強(qiáng)，同時(shí)沒有加劇其細(xì)胞毒性。此外，馬納維諾凝膠的抗病毒活性具有很好的穩(wěn)定性，即使在高于人體正常體溫的40 ℃，持續(xù)8周，抗病毒活性也沒有明顯降低，說明該凝膠可在人體內(nèi)長時(shí)間停留，并保持較高的抗病毒活性。這些結(jié)果提示馬納維諾凝膠有可能作為殺微生物劑來抑制HIV傳播，同時(shí)也為動(dòng)物水平的評(píng)價(jià)及臨床試驗(yàn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1] UNAIDS. UNAIDS report on the global AIDS epidemic 2013 [R/OL]. http://www.unaids.org/en/resources/documents/2013/name,85053,en.asp.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 2011年中國艾滋病疫情估計(jì)[R/OL]. www.moh.gov.cn/cmsresources/mohyzs/cmsrsdocument/doc13944.pdf. https://www.google.com.hk/webhp?hl=zh-CN&sourceid=cnhp.

[3] McGowan I. Microbicides for HIV prevention: reality or hope [J]? Curr Opin Infect Dis, 2010, 23(1):26-31.

[4] Morris GC, Lacey CJ. Microbicides and HIV prevention: lessons from the past, looking to the future [J]. Curr Opin Infect Dis, 2010, 23(1):57-63.

[5] Abdool KQ, Abdool KS, Frohlich JA, Grobler AC, Baxter C, Mansoor LE, Kharsany AB, Sibeko S, Mlisana KP, Omar Z, Gengiah TN, Maarschalk S, Arulappan N, Mlotshwa M, Morris L,Taylor D. Effectiveness and safety of tenofovir gel, an antiretroviral microbicide, for the prevention of HIV infection in women [J]. Science, 2010, 329(5996):1168-1174.

[6] Wilkin TJ,Gulick RM. CCR5 antagonism in HIV infection: current concepts and future opportunities [J]. Annu Rev Med, 2012, 63:81-93.

[7] Tan Q, Zhu Y, Li J, Chen Z, Han GW, Kufareva I, Li T, Ma L, Fenalti G, Li J, Zhang W, Xie X, Yang H, Jiang H, Cherezov V, Liu H, Stevens RC, Zhao Q, Wu B. Structure of the CCR5 chemokine receptor—HIV entry inhibitor maraviroc complex [J]. Science, 2013, 341(6152):1387-1390.

[8] Parra J, Portilla J, Pulido F, Sanchez-de LRR, Alonso-Villaverde C, Berenguer J, Blanco JL, Domingo P, Dronda F, Galera C, Gutierrez F, Kindelan JM, Knobel H, Leal M, Lopez-Aldeguer J, Marino A, Miralles C, Molto J, Ortega E, Oteo JA. Clinical utility of maraviroc [J]. Clin Drug Investig, 2011, 31(8):527-542.

[9] Wasmuth JC, Rockstroh JK, Hardy WD. Drug safety evaluation of maraviroc for the treatment of HIV infection [J]. Expert Opin Drug Saf, 2012, 11(1):161-174.

[10] Gulick RM, Lalezari J, Goodrich J, Clumeck N, DeJesus E, Horban A, Nadler J, Clotet B, Karlsson A, Wohlfeiler M, Montana JB, McHale M, Sullivan J, Ridgway C, Felstead S, Dunne MW, van der Ryst E, Mayer H. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection [J]. N Engl J Med, 2008, 359(14):1429-1441.

[11] Tien D, Schnaare RL, Kang F, Cohl G, McCormick TJ, Moench TR, Doncel G, Watson K, Buckheit RW, Lewis MG, Schwartz J, Douville K, Romano JW. In vitro and in vivo characterization of a potential universal placebo designed for use in vaginal microbicide clinical trials [J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 2005, 21(10):845-853.

[12] Haqqani AA, Tilton JC. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection [J]. Antiviral Res, 2013, 98(2):158-170.

[13] Henrich TJ,Kuritzkes DR. HIV-1 entry inhibitors: recent development and clinical use [J]. Curr Opin Virol, 2013, 3(1):51-57.

[14] Stone A. Microbicides: a new approach to preventing HIV and other sexually transmitted infections [J]. Nat Rev Drug Discov, 2002, 1(12):977-985.

[15] Weber J, Desai K, Darbyshire J. The development of vaginal microbicides for the prevention of HIV transmission [J]. PLoS Med, 2005, 2(5):e142.