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    沙門菌-斑馬魚感染模型用于自噬的研究

    2014-06-27 08:59:16李金玲王婷李嫄淵吳淑燕黃瑞
    微生物與感染 2014年2期
    關(guān)鍵詞:沙門幼魚斑馬魚

    李金玲,王婷,李嫄淵,吳淑燕,黃瑞

    蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院病原生物學系,蘇州 215123

    鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium,S.typhimurium)是一種重要的人畜共患病原菌,主要經(jīng)水和食物傳播,可引起食物中毒和胃腸炎等腸道傳染病,其感染發(fā)病率居沙門菌感染首位。2013年11月美國加利福尼亞州福斯特農(nóng)場發(fā)生了“問題雞肉事件”,波及20多個州,近400人在進食被沙門菌感染的雞肉后出現(xiàn)腸炎等癥狀。在我國,沙門菌的感染率也居高不下。已有研究發(fā)現(xiàn),針對感染發(fā)生的異源自噬在機體抑制細菌存活和繁殖、減輕機體感染等方面具有重要作用[1,2]。鼠傷寒沙門菌侵入細胞后會引起自噬的發(fā)生,細菌被包裹在雙層膜的自噬體中,最終被降解。因此,深入開展自噬機制的研究,對預防和控制細菌感染具有重要意義。

    斑馬魚具有體型短小、通體透明、世代間隔時間短和體外發(fā)育等優(yōu)勢,成為研究脊椎動物發(fā)育的優(yōu)良模式生物[3]。近年來,由于其在研究宿主與致病菌相互作用中發(fā)揮了不可替代的作用,越來越受到科學家的青睞。斑馬魚在受精后72 h(hours post-fertilization,hpf)會完成孵化,從“胚胎”過渡到“幼魚”[4]。此時斑馬魚能自由游動、主動覓食,且其自噬相關(guān)基因全部表達[5],可用于自噬的研究。但有關(guān)病原菌在斑馬魚體內(nèi)引起的異源自噬罕見報道。本研究用鼠傷寒沙門菌感染幼年斑馬魚,探討其對魚體內(nèi)自噬過程的影響,為致病機制的研究提供理論和實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1菌株及斑馬魚所用菌株為鼠傷寒沙門菌UF110、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記的UF110。野生型斑馬魚AB品系由蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院王晗教授惠贈。

    1.1.2試劑及儀器主要試劑包括氨芐西林(ampicillin,AMP),1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea, PTU),阿米卡星(amikacin,AMK),蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),兔抗p62、鼠抗Lc3(MBL公司),鼠抗β-actin(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司),兔二抗、鼠二抗(Abgent公司)。主要儀器包括體視顯微鏡(Olympus sz61),HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱,分光光度計(棱光),Allegra X-15R低溫高速離心機(Beckman-Coulter公司),熒光顯微鏡(Zeiss-Imager.M2),酶標儀(Biotek),PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad公司),H600透射電子顯微鏡(Hitachi公司)。

    1.2 方法

    1.2.1斑馬魚飼養(yǎng)將野生型AB品系斑馬魚胚胎放入Holtfreter Buffer(60 mmol/L NaCl、0.67 mmol/L KCl、1.3 mmol/L CaCl2、0.3 mmol/L NaHCO3,pH 7.0)培養(yǎng)液中,置于28.5 ℃培養(yǎng)箱內(nèi),按光照14 h、黑暗10 h的條件培養(yǎng),及時換液并在體視顯微鏡下去除未受精或死亡的胚胎。

    1.2.2細菌浸染實驗參照文獻[6],挑單個菌落至3 ml LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)14~16 h至對數(shù)生長期。按1∶10重新接種于DMEM培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)3 h。收集菌液離心后用滅菌的Holtfreter Buffer培養(yǎng)液洗3次后重懸,測定600 nm處的光密度(optical density,OD)值以求菌液密度,同時做平板菌落計數(shù)。用Holtfreter Buffer稀釋菌液至1×1010CFU/ml、5×109CFU/ml、1×109CFU/ml、5×108CFU/ml、5×107CFU/ml、5×106CFU/ml,浸染72 hpf斑馬魚。每個劑量感染20條斑馬魚,連續(xù)觀察7 d,計數(shù)斑馬魚的死亡數(shù),并繪制存活率曲線。

    1.2.3熒光顯微鏡實時監(jiān)測根據(jù)上述實驗結(jié)果,用1×109CFU/ml GFP-UF110感染72 hpf幼年斑馬魚,于感染后不同時間點收集斑馬魚,在熒光顯微鏡下觀察細菌的入侵狀況。觀察的胚胎和幼魚在24 hpf前用0.003%的PTU處理以阻止黑色素產(chǎn)生。

    1.2.4細菌計數(shù)根據(jù)上述實驗結(jié)果,用1×109CFU/ml細菌感染斑馬魚,分別在感染6、8、10、12、14、16和24 h后計數(shù)斑馬魚體內(nèi)的細菌量。參照文獻[6],每組10條斑馬魚,用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗3次,然后用100 μl PBS將其研磨均勻,取50 μl研磨液稀釋后直接加入軟瓊脂中傾注SS平板,37 ℃培養(yǎng)過夜,計數(shù)平板上有黑色中心的細菌數(shù)即每條魚體感染的細菌量;剩余50 μl研磨液在AMK(100 μg/ml)中28.5 ℃孵育2 h殺死胞外菌,稀釋后加入軟瓊脂中傾注SS平板,37 ℃培養(yǎng)過夜,計數(shù)細菌數(shù)即侵入細胞內(nèi)的細菌量。以上每組均設(shè)3個平行組。

    1.2.5蛋白免疫印跡法檢測自噬蛋白Lc3及p62將細菌與斑馬魚共培養(yǎng)一定時間后,收集斑馬魚,加入裂解液研磨后測定蛋白濃度。取60 μg樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)(濃縮膠90 V,30 min;分離膠110 V,90 min);電泳完成后,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上(200 mA,75 min)。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min;加入鼠抗β-actin(1∶3 000)、鼠抗Lc3(1∶1 500)和兔抗p62(1∶1 500),4 ℃孵育過夜。次日室溫孵育1 h,用含吐溫20的Tris緩沖液(Tris buffered saline with Tween-20, TBST)洗3次;加入鼠二抗(1∶3 000)、兔二抗(1∶3 000),室溫孵育90 min,TBST洗3次?;瘜W發(fā)光法顯影,檢測Lc3和p62蛋白的表達。

    1.2.6透射電子顯微鏡觀察自噬體收集感染后的幼年斑馬魚,用PBS洗2~3次。參照文獻[7],用2.5%戊二醛與2%多聚甲醛混合固定液固定4 h以上。PBS洗后,鋨酸固定1 h,然后依次進行梯度丙酮脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片機切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,最后在透射電子顯微鏡下觀察自噬體結(jié)構(gòu)。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理,多組平均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 沙門菌-斑馬魚感染模型適宜菌量的確定

    用不同密度鼠傷寒沙門菌浸染72 hpf斑馬魚,斑馬魚在7 d內(nèi)的存活率曲線顯示,1×1010CFU/ml和5×109CFU/ml細菌量分別使斑馬魚于感染第1、2天開始死亡; 1×109CFU/ml細菌量感染2 d內(nèi)對斑馬魚無顯著影響,感染后3 d該魚出現(xiàn)尾巴卷曲、游動時協(xié)調(diào)性和靈活能力下降的癥狀,并有死亡現(xiàn)象。5×108CFU/ml、5×107CFU/ml、5×106CFU/ml細菌量分別使斑馬魚在感染后4、5 d出現(xiàn)死亡,但死亡率較低,表明這3個密度對斑馬魚影響較小(圖1)。根據(jù)研究目的,選擇感染后2 d內(nèi)對斑馬魚存活無顯著影響的1×109CFU/ml為后續(xù)實驗用細菌量。

    圖1 不同密度鼠傷寒沙門菌感染斑馬魚的存活率曲線Fig.1 The survival of zebrafish larvae infected by different doses of S. typhimurium

    2.2 沙門菌在斑馬魚體內(nèi)的播散

    1×109CFU/ml GFP-UF110感染72 hpf幼年斑馬魚后,熒光顯微鏡實時監(jiān)測結(jié)果顯示,感染后4 h斑馬魚口周及卵黃囊中均有細菌侵入(圖2B),8 h斑馬魚腸道中可檢測到細菌信號(圖2C), 此后細菌逐步播散,1 d后眼睛周圍及頭部出現(xiàn)綠色細菌信號(圖2D),2 d后播散至斑馬魚整個頭部(圖2E),3 d后遍布斑馬魚全身(圖2F)。

    Real-time analysis of S. typhimurium in zebrafish larvae after infection. Zebrafish larvae were immersed in 1×109 CFU/ml of S. typhimurium expressing GFP at 72 hpf. A: Uninfected zebrafish larva. B: 4 h after infection. C: 8 h after infection. D: 1 d after infection. E: 2 d after infection. F: 3 d after infection. Pictures were taken with an epifluorescence Zeiss microscope. Scale bar, 100 μm.

    收集感染后6、8、10、12、14、16和24 h的斑馬魚進行AMK殺菌實驗。細菌計數(shù)結(jié)果顯示,未加AMK組整條魚體感染的細菌量隨時間延長而增加,感染后10 h細菌量顯著高于8 h(圖3A);加入AMK殺死胞外菌后,細菌量明顯降低,且感染后10 h魚體中侵入細胞內(nèi)的細菌量顯著低于8 h(圖3B),表明此階段幼魚體內(nèi)發(fā)生了較強的抵御細菌入侵或殺滅細菌的保護性反應。

    The number of bacteria in the whole-larvae is increasing after infection over time, but not the intracellular bacterial number. Triplicate groups of five larvae were analyzed for each biological replicate represented by a single dot. A: Whole-larvae bacterial number from 6 h to 24 h after infection. B: Intracellular bacterial number from 6 h to 24 h after infection. ***P<0.001.

    2.3 沙門菌-斑馬魚感染模型中自噬的變化

    從感染后8~10 h,胞內(nèi)細菌量明顯下降,為檢測此現(xiàn)象與自噬的關(guān)系,用蛋白免疫印跡法檢測感染后不同時間點幼年斑馬魚自噬相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示,細菌與斑馬魚共作用8 h后,自噬標記蛋白Lc3-Ⅱ的表達顯著高于對照組及其他時間點,自噬底物p62蛋白的表達則顯著降低;感染后10 h上述趨勢仍存在,但差異不顯著(圖4A)。結(jié)果表明,自噬過程可能影響了此階段侵入幼魚細胞內(nèi)細菌的繁殖。

    收集未感染及感染8 h的幼年斑馬魚,用固定液固定后制備超薄切片。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),未感染幼年斑馬魚體內(nèi)未見明顯的自噬體結(jié)構(gòu)(圖5A);感染后8 h幼魚體內(nèi)可觀察到腫脹的線粒體結(jié)構(gòu),表明細菌感染引起幼魚體內(nèi)變化,同時還觀察到包裹著細菌的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)及降解內(nèi)容物的單層膜自噬溶酶體結(jié)構(gòu)(圖5B、C)。

    Zebrafish larvae were treated with 1×109 CFU/ml UF110 for different hours. A: Total lysate was prepared and subjected to immunoblot analysis. B: Relative ratio of Lc3-Ⅱ/β-actin was quantified. C: Relative ratio of p62/β-actin was quantified. *P<0.05, **P<0.01.

    Transmission electron micrographs of zebrafish larvae at 80 hpf. Sections are transverse through the yolk in the region of intestinal bulb. A: Uninfected zebrafish larvae. B and C: 8 h after infection. Black arrowhead shows the clear double membrane. Black arrow shows the bacterium. White arrow shows the autolysosome. White arrowhead shows the swelling of mitochondria. Scale bar, 1 μm.

    3 討論

    作為一種異于凋亡的細胞程序性死亡方式,自噬正日益受到關(guān)注。自噬是真核細胞特有的生命現(xiàn)象,經(jīng)起始、成核、延伸和成熟4個階段,形成一個包裹著長壽命蛋白、破損細胞器或外來異物等的雙層膜泡結(jié)構(gòu)——自噬體[8]。最終自噬體與溶酶體融合將內(nèi)容物降解,實現(xiàn)細胞本身需要的代謝及細胞器的更新[9]。自噬不僅參與細胞生長發(fā)育、成熟分化及死亡調(diào)控過程,還是細胞對外界不良刺激的一種防御機制[10]。自噬異常會導致多種疾病的發(fā)生,如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、糖尿病、新陳代謝紊亂、擴張性心肌病和病原體感染等[8]。此外,自噬途徑涉及天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的諸多方面,一方面可通過形成自噬溶酶體清除入侵的微生物,發(fā)揮天然抗感染免疫作用;另一方面可通過參與抗原加工、呈遞過程,在獲得性免疫中發(fā)揮作用[11]。因此,當發(fā)生病毒入侵或細菌感染時,自噬能及時捕捉并降解這些病原體以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[12,13]。

    Lc3是酵母atg8基因的同源物,參與早期自噬體的形成,主要有Lc3-Ⅰ和Lc3-Ⅱ兩種形式。Lc3-Ⅰ是胞質(zhì)可溶性的,在自噬未發(fā)生上調(diào)時常規(guī)表達;當自噬發(fā)生時,經(jīng)泛素化修飾后,與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)結(jié)合,成為膜結(jié)合形式的Lc3-Ⅱ。Lc3-Ⅱ主要存在于前自噬體和自噬體上,是自噬體的標記,其含量與自噬泡數(shù)目呈正相關(guān),在一定程度上反映了自噬水平[14]。蛋白免疫印跡法檢測Lc3-Ⅱ表達量可確定自噬水平,是一種簡單、有效的檢測自噬活性及自噬通量的方法。p62既是一種接頭蛋白,又是一種自噬底物蛋白。作為接頭蛋白,其一端結(jié)合泛素化的蛋白,一端與Lc3相連,參與自噬體形成[15]。作為自噬底物蛋白,其能被自噬過程有效降解[16,17]。當自噬活性升高時,p62 mRNA表達水平不變,蛋白卻降解[18]。因此,p62蛋白表達水平與自噬活性呈負相關(guān)[15-18,19]。

    斑馬魚是研究自噬功能與機制的良好模型[5,20]。科學家發(fā)現(xiàn)參與自噬的基因和蛋白在48 hpf胚胎中的表達顯著增高,自噬的上調(diào)發(fā)生在胚胎發(fā)育至第2、3天的咽裂期[5]。72 hpf斑馬魚已破膜而出進入“幼魚”階段,能自由移動并開始主動覓食[4],此時用不同密度細菌對其進行浸染實驗,根據(jù)斑馬魚2 d內(nèi)的死亡情況選擇1×109CFU/ml細菌量為后續(xù)實驗菌量。幼年斑馬魚通體透明,可實時監(jiān)控其與病原菌的相互作用;而用小鼠感染模型進行活體監(jiān)測相對困難。本實驗用GFP標記的鼠傷寒沙門菌感染斑馬魚后,發(fā)現(xiàn)感染后4 h斑馬魚體內(nèi)有細菌入侵,此后逐步播散,直至3 d遍布全身。

    最近科學家利用靜脈注射的方法構(gòu)建了福氏志賀菌-斑馬魚感染模型,發(fā)現(xiàn)在感染后4 h和24 h時斑馬魚體內(nèi)均有自噬發(fā)生,且p62在此過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。該實驗還發(fā)現(xiàn),自噬激活劑西羅莫司(rapamycin,雷帕霉素)在此模型中并未發(fā)揮促進清除細菌和保護斑馬魚的作用[20]。靜脈注射法雖能保證感染細菌量的精確性,但浸染法作用溫和,且更接近自然感染狀態(tài)。本實驗用1×109CFU/ml鼠傷寒沙門菌浸染72 hpf幼年斑馬魚,發(fā)現(xiàn)8~10 h侵入細胞內(nèi)的細菌數(shù)逐漸減少;此階段自噬相關(guān)蛋白Lc3-Ⅱ表達顯著增高,自噬底物蛋白p62水平顯著降低,且在感染后8 h幼魚細胞中觀察到自噬體和自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。細菌引起的異源自噬發(fā)生時,雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)能將細菌包裹起來,最終在自噬溶酶體中將其降解,從而減少細菌數(shù)目,減輕感染。上述結(jié)果表明,自噬在抵御胞內(nèi)細菌的生長和繁殖中發(fā)揮了重要作用,自噬水平的提高可能是斑馬魚抗鼠傷寒沙門菌感染的一種機制。

    本研究用鼠傷寒沙門菌浸染幼年斑馬魚,建立的沙門菌-斑馬魚感染模型可用于自噬的研究,該模型簡單、方便、易于操作。鑒于斑馬魚在研究病原菌感染方面的優(yōu)勢,下一步擬利用該模型探究某些藥物(如自噬激活劑Torin1、自噬抑制劑氯喹等)對斑馬魚異源自噬的影響。此外,用斑馬魚構(gòu)建突變品系相對容易,該模型將對進一步明確沙門菌誘導體內(nèi)自噬的發(fā)生機制提供便利,為抑制或殺滅入侵體內(nèi)的沙門菌提供新思路。

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