嬰幼兒淋巴結核病原體及多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析

鄧桂林，錢雪琴， 武潔，沈鑫， 張軍，盧水華，沈芳

1. 上海市(復旦大學附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2. 上海市疾病預防控制中心，上海 200336

卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)是一種牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)減毒活疫苗，可有效預防播散性結核病發(fā)生，如結核性腦膜炎、粟粒型肺結核。BCG感染通常發(fā)生于免疫功能低下的接種人群，如慢性肉芽腫病(chronic granulomatous disease，CGD)患者、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease，SCID)患者和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficency virus，HIV)感染者，其發(fā)病率為0.1/100萬～4.3/100萬，病死率為50%～71%[1-3]。抗結核一線藥物為利福平、異煙肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺，而BCG對吡嗪酰胺天然耐藥[2]，對異煙肼的敏感度亦有所減低[4]，應用一線藥物治療可能導致病情延誤、加重，甚至死亡。因此，區(qū)分BCG感染與結核分枝桿菌感染對治療及預后很重要。國內關于BCG感染已有多篇報道，但大多根據(jù)預防接種史及臨床表現(xiàn)作出分析，較少應用分子生物學方法進行鑒別。本研究對73例0～3歲淋巴結核患兒的淋巴結穿刺液陽性培養(yǎng)物進行菌型鑒定及多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(multiple-locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)，以了解嬰幼兒淋巴結核的主要病原體及其分子生物學信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源H37Rv、牛分枝桿菌和BCG由上海市疾病預防控制中心提供；79株臨床分離株來自上海市(復旦大學附屬)公共衛(wèi)生臨床中心的73例0～3歲淋巴結核患兒淋巴結穿刺液標本(男53例、女20例)，其中5例患兒存在重復菌株(男4例有5株重復，女1例有1株重復)。

1.1.2主要儀器及試劑所用儀器及試劑包括基因擴增儀(Bio-Rad公司)、凝膠成像儀(Bio-Rad公司)、分析軟件Quantity One (Bio-Rad公司)、試劑盒Mycobacterium tuberculosis Typing Kit Ⅰ(北京康為世紀生物科技有限公司)、試劑盒2×Taq PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1化學法取新鮮培養(yǎng)物(2～3周)，以含0.5% 吐溫80的生理鹽水配制成10-2mg/ml的懸液，用10 μl標準接種環(huán)接種1支對硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)培養(yǎng)基、1支噻吩-2-羧酸肼(thiophene-2-carboxylic acid hydrazide，TCH)培養(yǎng)基和2支改良L-J培養(yǎng)基。接種后1支L-J培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)，PNB培養(yǎng)基、TCH培養(yǎng)基和另1支L-J培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)4周，觀察各培養(yǎng)基上菌落生長情況。37 ℃ L-J培養(yǎng)基菌落生長良好，則繼續(xù)觀察28 ℃ L-J培養(yǎng)基、37 ℃ PNB培養(yǎng)基、37 ℃ TCH培養(yǎng)基的生長情況。28 ℃L-J培養(yǎng)基和(或)37 ℃ PNB培養(yǎng)基上有菌落生長判為非結核分枝桿菌；28 ℃L-J培養(yǎng)基和37 ℃ PNB培養(yǎng)基上無菌落生長判為結核分枝桿菌復合群。37 ℃ TCH培養(yǎng)基上有菌落生長為人型結核分枝桿菌；37 ℃ TCH培養(yǎng)基上無菌落生長考慮為牛分枝桿菌。若37 ℃L-J培養(yǎng)基菌落生長不良，則繼續(xù)放置至8周觀察，結果判斷亦同。具體操作參見《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[5]。

1.2.2核酸提取雙蒸水制備菌懸液，80 ℃滅活30 min，100 ℃水浴10 min，立即置冰上2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3分子生物學鑒定根據(jù)Mycobacterium tuberculosis Typing Kit Ⅰ試劑盒操作說明書進行檢測及結果判讀。

1.2.4結核分枝桿菌復合群鑒定根據(jù)Parsons等[6]的設計進行引物合成和結果判斷，生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成。具體序列見表1。擴增片段包括RD1、 RD9和RD10。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增反應體系為20 μl，其中含上、中、下引物(10 pmol/L)各0.4 μl，2×Taq PCR MasterMix 10 μl，模板1 μl，雙蒸水補至反應體積。反應條件：預變性94 ℃ 10 min；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；后延伸72 ℃ 7 min。取3 μl擴增產物，以50 bp DNA Marker為標準，于1%瓊脂糖凝膠12.5 V/cm電泳40 min，用凝膠成像儀掃描成像。

表1 缺失區(qū)擴增用引物序列Tab.1 Primer sequences for deleted region analysis

1.2.5MLVA分型根據(jù)Mycobacterium tuberculosis Typing Kit Ⅰ試劑盒操作說明書進行檢測及結果判讀，位點包括QUB-11b、QUB-18、QUB-26、QUB-4156、QUB-1895、MIRU26、MIRU31、MIRU10、MIRU40、Mtub21、Mtub04和ETR-F。結果輸入http: //www.miru-vntrplus.org進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果

2.1 分枝桿菌鑒定

傳統(tǒng)化學法培養(yǎng)4周，79株菌株在37 ℃ L-J培養(yǎng)基菌落生長均良好，在37 ℃ PNB和28 ℃ L-J培養(yǎng)基上均無菌落生長；3株在37 ℃ TCH培養(yǎng)基上可見明顯菌落生長。據(jù)此判斷79株菌株為結核分枝桿菌復合群，其中76株可能為牛分枝桿菌，3株為人型結核分枝桿菌。

對PCR產物進行擴增，結果顯示，79株菌株中有3株存在850 bp和361 bp產物，76株僅存在850 bp產物，所有菌株的擴增產物條帶清晰，無雜帶干擾。根據(jù)試劑盒操作說明書，79株菌株均判為結核分枝桿菌復合群，其中3株為人型結核分枝桿菌。

2.2 結核分枝桿菌復合群鑒定

RD1、RD9和RD10擴增產物顯示，H37Rv和3株臨床分離株RD1、RD9和RD10均存在(圖1)；牛分枝桿菌存在RD1，缺失RD9、RD10；BCG和76株臨床分離株RD1、RD9和RD10均缺失。由此可見，79株菌株中，76株為BCG菌株，3株為人型結核分枝桿菌。76株BCG分別來自70例患兒，占95.9%(70/73)；人型結核分枝桿菌則占4.1%(3/73)。

2.3 MLVA分型

人型結核分枝桿菌與BCG間存在多態(tài)性差異(圖2)。經12位點分析，獲得4個基因型(表2)。其中3株為獨立基因型；76株成簇，結合2.2結果顯示為BCG菌株，即為同一來源。3株獨立基因型菌株經結核分枝桿菌復合群鑒定為人型結核分枝桿菌。4個基因型與數(shù)據(jù)庫菌株比較，BCG菌株與牛分枝桿菌具有親源性，3株人型結核分枝桿菌則屬結核分枝桿菌北京基因型(圖3)。

A: RD1. B: RD9. C: RD10.M, 50 bp DNA marker; Rv, H37Rv; MB, Mycobacterium bovis; Lanes 1-11, isolates.

M, 50 bp marker; Lanes 1-10, isolates; Rv, quality control H37Rv. Rv and lane 7 showed 5 alleles (422 bp), lane 6 showed 6 alleles (491 bp) and other lanes showed 3 alleles (284 bp).

圖3 4個基因型的輻射進化樹Fig.3 Radial neighbor-joining tree of four genotypes (including reference strains in tree)

表2 MLVA基因型及重復序列數(shù)Tab.2 Genotypes and numbers of MLVA

3 討論

BCG是一種牛分枝桿菌經236代人工培養(yǎng)形成的減毒活疫苗，主要用于結核病預防，也可用于膀胱癌治療。因其為減毒活疫苗，當免疫力低下人群接種BCG時，有可能導致感染。有文獻報道，某些疾病的治療亦可引起B(yǎng)CG感染[7-9]。診斷時，傳統(tǒng)化學方法操作復雜、耗時長，且難以區(qū)分牛分枝桿菌與BCG[10]。隨著全基因組測序技術的廣泛開展，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，與牛分枝桿菌相比，BCG存在RD1缺失；與人型結核分枝桿菌相比，BCG存在RD1、RD9和RD10缺失。本研究對來自73例淋巴結核患兒的79株臨床分離株進行以上片段擴增，結果顯示多數(shù)為BCG感染，少數(shù)為人型結核分枝桿菌感染。結果提示，BCG是多數(shù)嬰幼兒淋巴結核的病原體。

BCG對吡嗪酰胺天然耐藥[2]，對異煙肼的敏感度逐漸降低[4]。當異煙肼最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)升高時，藥物劑量也應升高，從而達到有效殺菌目的。若只使用常規(guī)劑量，僅能抑制BCG生長而無法獲得有效殺滅。應用利福平聯(lián)合異煙肼進行常規(guī)劑量治療，可能誘發(fā)BCG多重耐藥[11]。本研究結果表明，與人型結核分枝桿菌感染相比，對BCG感染更應采取個性化治療，以取得理想療效。

MLVA是一種以可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(variable number tandem repeat, VNTR)為分子標識基礎的分型方法，具有重復性好、特異度高、結果數(shù)據(jù)化、操作簡單、實驗時間短等特點。可變數(shù)目重復序列可因結核分枝桿菌來源不同而串聯(lián)重復數(shù)不同，其側翼序列高度保守，主要用于結核分枝桿菌的流行病學調查[12]，監(jiān)測傳染病的傳染源。本研究中76株BCG的MLVA表現(xiàn)完全一致，而3株人型結核分枝桿菌無同源性，與BCG比對亦無同源性，提示該方法鑒定BCG有較高的準確率。

淋巴結核的主要感染途徑[13]有以下幾條：①皮膚黏膜接種感染。感染的細菌經淋巴管到達引流區(qū)的淋巴結而發(fā)病，此途徑的原發(fā)病灶通常為皮膚黏膜。本研究中70例BCG感染患兒通過此途徑感染。②淋巴管直接蔓延。原發(fā)病灶的結核分枝桿菌經淋巴管流入肺內淋巴結和支氣管淋巴結，或蔓延至其他淋巴結，從而引起淋巴結核，此種感染方式原發(fā)病灶通常位于肺部。3例人型結核分枝桿菌感染患兒中，1例肺部病灶不明顯，僅局部淋巴結受累，可能通過此途徑感染。③血行播散。血行播散導致的淋巴結核通常為全身性多部位結核病變，淋巴結核僅為局部表現(xiàn)形式。3例人型結核分枝桿菌感染病例中，2例存在多部位感染，受累部位包括肺、淋巴結、骨、腹膜等，考慮為此途徑感染。

BCG引起嬰幼兒淋巴結核可能與3個因素相關：①患兒存在免疫狀態(tài)改變或遺傳因素改變。結核病免疫主要依靠細胞免疫，BCG亦如此，T細胞免疫缺陷可導致BCG易感。對于免疫功能正常的健康人群，分枝桿菌侵入機體后，CD4+輔助/誘導T細胞產生γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)、腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor β，TNF-β)等細胞因子，誘導巨噬細胞吞噬細菌；同時，巨噬細胞和樹突細胞分泌IL-12和IL-23，正反饋調節(jié)IFN-γ產生。CD8+抑制性/細胞毒性T細胞則通過溶解吞噬細菌后的巨噬細胞以清除病原體。當患者存在IFN-γ結構異常，或分泌異常，或調節(jié)異常，均可導致感染[14,15]。李惠民等[16]報道，在18例播散性BCG感染病例中，12例存在原發(fā)性免疫缺陷病，包括CGD、IL-12/IFN-γ通路缺陷、SCID等，6例存在不確定的免疫缺陷。國外亦有相似報道[17]。②BCG因素。BCG從1921年開始應用于臨床，各個國家由于運輸、保存及傳代用培養(yǎng)基不同，產生了不同亞型，而新亞型的產生直至1966年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)規(guī)范了疫苗的保存和轉種方法才得以阻止。現(xiàn)用的BCG主要分為兩大類，第1類含有大量MPB70蛋白表達基因，包括2個IS6110插入序列及可表達甲基分枝菌酸和MPB64蛋白的基因，其代表亞型有BCG Tokyo、 BCG Moreau、BCG Russia和BCG Sweden。第2類僅含有少量MPB70蛋白表達基因，包括單個IS6110插入序列及無表達甲基分枝菌酸和MPB64蛋白的基因，代表亞型有BCG Pasteur、BCG Copenhagen、BCG Glaxo和BCG Tice。我國所用的BCG為1947年突變生成的亞型，屬第2類[18]。其與Calmette-Guérin最初研制的BCG相比，存在RD2缺失、IS6110_phoP缺失及串聯(lián)重復改變。Pan等[19]對4種BCG進行全基因組測序，顯示4種疫苗亦存在基因和單核苷酸多態(tài)性不同。RD2包含多個基因，該區(qū)域基因的Rv1979c至Rv1982缺失會引起免疫反應下降[20]，Rv1985c至Rv1986缺失則無改變。③衛(wèi)生防疫工作人員因素。衛(wèi)生防疫工作人員未嚴格掌握BCG接種禁忌證[21]，如給接受免疫抑制劑治療的患兒接種BCG，操作不規(guī)范，使用前未完全混合而使接種濃度過高、接種量超標或注射過深(注入皮下或肌內)[22]。

本研究不足之處在于患兒來自全國不同省市，接種的BCG制品來自不同生產廠家，故未能收集相應的BCG樣品，缺乏MLVA分析結果。

綜上所述，BCG是引起嬰幼兒淋巴結核的主要病原體，臨床分離的BCG其MLVA分型無差異。

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