融合基因CDglyES重組腺病毒對卵巢癌細胞抑制作用的體外研究

李 圃 李冬田 尹冰楠 湯 華 尹利榮

融合基因CDglyES重組腺病毒對卵巢癌細胞抑制作用的體外研究

李 圃①②李冬田③尹冰楠③湯 華③尹利榮②

目的：構(gòu)建含CDglyES融合基因的重組腺病毒，體外觀察其對人卵巢癌細胞的直接抑制作用及其對血管內(nèi)皮細胞生長的抑制作用。方法：用細菌內(nèi)同源重組方法構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒prAdCDglyES。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293包裝細胞，擴增獲取重組腺病毒rAdCDglyES。采用MTT法觀察rAdCDglyES對卵巢癌細胞SKOV-3生長抑制的影響，同時觀察其表達產(chǎn)物抑制臍靜脈血管內(nèi)皮細胞ECV-304增殖的作用。結(jié)果：純化的rAdCDglyES滴度是1×1013.3TCID50/L，其對SKOV-3細胞生長抑制率是（83.1±6.3）%，與對照組rAd-LacZ（24.1±13.2）%相比有顯著性差異（P＜0.01）。濃縮的轉(zhuǎn)染rAdCDglyES的細胞培養(yǎng)上清液抑制ECV-304細胞增殖，抑制率是（78.7±1.6）%，而同樣濃縮的轉(zhuǎn)染rAd-CD的細胞培養(yǎng)上清液抑制率是（23.9±9.7）%，二者有顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論：研究結(jié)果表明重組腺病毒rAdCDglyES具有體外直接和間接抑制人卵巢癌細胞效能。

人卵巢癌細胞 胞嘧啶脫氨酶基因 內(nèi)皮抑素 重組腺病毒 基因治療

1Department of Gynecologic Oncology,Tianjin Central Hospital of Gynecology and Obstetrics,Tianjin 300100;2Department of

gynaecology and obstetrics,The 2nd Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,3Department of Microbiology,Tian

jin Medical University,Tianjin 300070,China.

This work was supported by the funds of Tianjin Municipal Natural Science Research Program(No.013615811).

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌和子宮體癌而列居第三位，但其死亡率卻居婦科惡性腫瘤之首［1］。2008年每年新發(fā)病例高達22.6萬例，病死人數(shù)14萬人［2］。卵巢癌組織學類型多，缺乏有效的早期診斷方法，80%卵巢癌患者在晚期出現(xiàn)典型癥狀和確診，且手術(shù)和放化療療效不佳，卵巢癌患者的初診后5年生存率僅為30%，再加上卵巢癌復(fù)發(fā)性和耐藥問題，嚴重威脅患者生命［3-4］。因此，尋找新的治療方法迫在眉睫。

隨著免疫學、分子生物學及基因工程技術(shù)的飛躍發(fā)展，誕生了生物療法。生物療法為癌癥的治療提供了一個新途徑。惡性腫瘤的基因治療即是將表達產(chǎn)物有治療作用的外源性基因?qū)肴梭w，最終達到直接或間接抑制或殺傷腫瘤細胞的目的。重組腺病毒是臨床應(yīng)用最為廣泛的基因治療載體，目前有少量方案進入Ⅲ期臨床試驗［5-6］。胞嘧啶脫氨酶（cytidine deaminase，CD）基因產(chǎn)物胞嘧啶脫氨酶可將無細胞毒性的抗真菌藥物氟胞嘧啶5-FC轉(zhuǎn)化為氟尿嘧啶5-FU，通過細胞毒性作用殺死腫瘤細胞［7］。內(nèi)皮抑素（endostadine，ES）基因的產(chǎn)物內(nèi)皮抑素能抑制內(nèi)皮細胞增生、轉(zhuǎn)移和新血管的生成，這些對腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移有重要意義［8］。本研究首先構(gòu)建了含CD和ES的融合基因的重組腺病毒。該重組體能表達胞嘧啶脫氨酶，可將無細胞毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為具有細胞毒性的化療藥直接殺傷瘤細胞；同時表達內(nèi)皮抑素，通過抑制腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞阻止瘤組織新生血管形成，使瘤組織缺血、缺氧，導(dǎo)致瘤細胞死亡，并阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成。進一步觀察該重組腺病毒對人卵巢癌基因治療的體外實驗研究，結(jié)果論述如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質(zhì)粒及菌株：重組質(zhì)粒pAdE1CMV-CD（含CD基因）、質(zhì)粒pEZZ18-ES（含ES基因）本室構(gòu)建；本室保存DH5α細胞；pAdTrack-CMV（腺病毒載體穿梭質(zhì)粒）、pAdEasy-1（腺病毒骨架質(zhì)粒）、宿主菌BJ5183、DH10B購自Bert Vogelstein公司。細胞系為本室保存293細胞和人卵巢癌細胞株SKOV-3；人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞ECV-304是由中國醫(yī)學科學院血液病研究所提供。限制性內(nèi)切酶：XbaⅠ、HindⅢ、BglⅠ、PacⅠ、BamHⅠ、KpnⅠ、PmeⅠ均購自美國NEB公司；Taq E購自美國Promega公司。CD上游引物為：5'-GAAG ATCTAGGCT AGCAATGTCGAATAACGCT-3'；下游引物為：5'-CCC AAGCTTGGGGGTACCTCCACGTTTGT AATCGAT-3'；ES上游引物為：5'-CGGGGTACCGG AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATTTATG CACAGCCACCGCGACTT-3'；下游引物為：5'-GCTCT AGATCACTTGGAGGCAGTCAT-3'。

1.2 方法

1.2.1 含CD基因穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 擴增CD基因：以pAdE1CMV-CD為模板，用CD上、下游引物常規(guī)方法擴增；純化CD基因：采用PCR純化試劑盒（Clonetech，USA）推薦方法，備用；小量制備腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV：按《分子克隆》所述方法，-20℃保存；構(gòu)建成穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV-CD并鑒定：BglⅡ和HindⅢ酶切后的pAdTrack-CMV與CD按1∶3分子比混合，16℃連接30min，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化DH5α細胞。BglⅡ和HindⅢ雙酶切后電泳，PCR方法鑒定。

1.2.2 含CDglyES融合基因穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 PCR擴增ES基因：以pEZZ18-ES質(zhì)粒為模板，用glyES上游和下游引物常規(guī)擴增ES基因；構(gòu)建并鑒定pAdTrackCMV-CDglyES：經(jīng)BglⅡ和XbaⅠ雙酶切后連接pAdTrackCMV-CD和glyES，方法同前；用CD上游引物和glyES下游引物進行PCR擴增CDglyES，觀察1.9 kb大小特異條帶，BglⅡ和XbaⅠ雙酶切pAdTrackCMV-CdglyES后電泳，觀察9.2 kb和1.9 kb特異性條帶鑒定pAdTrackCMV-CDglyES。

1.2.3 重組腺病毒rAdCDglyES的構(gòu)建 1）細菌內(nèi)同源重組prAdCDglyES質(zhì)粒及鑒定 用PmeⅠ酶將pAdTrackCMV-CDglyES 1 μg切成線性，乙醇沉淀干燥后溶于6 μL滅菌雙蒸水中。與0.1 μg pAdEasy-1質(zhì)?；旌虾筠D(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中。加入12 μL感受態(tài)菌BJ5183，于Bio-Rad gene pulser中完成電穿孔，條件是2 500 V，200 ohms，25 μF。立即取出穿孔的細胞放入備好的500 μL LB中，120rpm 37℃水浴搖床緩慢搖動30 min，將200 μL涂于Kana+LB平板，37℃過夜。挑取較小菌落常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，PCR和PacⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定。酶切后純化CDglyES基因片段進行測序確認。2）脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細胞擴增rAdCDglyES 轉(zhuǎn)染前24 h，6孔板中接種293細胞1×108/L，待融合成片約70%時，棄去營養(yǎng)液，DMEM洗1次，加入適量DMEM培養(yǎng)液，CO2孵箱中培養(yǎng)待用。備好PacⅠ酶消化成線性的rAdCDglyES，乙醇沉淀干燥，溶于6 μL滅菌蒸餾水中，將DMEM 500 μL和脂質(zhì)體20 μL制備為轉(zhuǎn)染混合液，置室溫30 min。將293細胞中的DMEM棄去，加入轉(zhuǎn)染混合液和2.5 mL DMEM，CO2孵箱培養(yǎng)4 h后換營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察綠色熒光蛋白質(zhì)（green fluorescence，GFP）表達監(jiān)控細胞轉(zhuǎn)染情況。293細胞發(fā)生病變、部分脫落時收獲病毒，凍融3次取上清液3 mL，再感染293細胞，連續(xù)傳代擴增重組病毒至第10代。

1.2.4 重組腺病毒純化和滴度測定 96孔板中接種293細胞，培養(yǎng)成單層細胞，用培養(yǎng)維持液把rAdCDglyES病毒液稀釋為10-1至10-11，每孔0.1 mL，每個濃度4個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)7 d，每天觀察細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）情況。依據(jù)Reed-Muench公式計算其滴度。

重組腺病毒培養(yǎng)上清液6 000 rpm 4℃離心10 min，每8 mL病毒上清液加4.4 g CsCl充分混合，再加入SW-41轉(zhuǎn)子用的12 mL離心管中。指甲油2 mL覆蓋后32 000 rpm 20 h 10℃超離。收集并合并所有收集的病毒液，透析后與等體積的2×貯存緩沖液混合，保存于-20℃。

1.2.5 腫瘤細胞抑制實驗 用0.02%EDTA消化液將生長良好的腫瘤細胞SKOV-3消化為單個細胞，將細胞用1640營養(yǎng)液稀釋為1×108個細胞/L，接種于96孔板中，第1列加0.1 mL營養(yǎng)液，而其余各孔加細胞液0.1 mL，37℃5%CO2培養(yǎng)為單層細胞。吸棄上清，將空白對照（第1列）和細胞對照（第2列）加入營養(yǎng)液，自第3列后依次加入rAd-lacZ，rAd-CD和rAd-CDglyES重組腺病毒各3列，均用營養(yǎng)液稀釋為1010TCID50/L，0.1 mL/孔，37℃5%CO2培養(yǎng)12 h。棄病毒液，RPMI1640液洗2次，加入新鮮營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。吸棄上清并分別加入0和2 g/L 5-氟胞嘧啶（5-FC），0.1 mL/孔，37℃5%CO2培養(yǎng)48 h。每孔加10 μL MTT溶液，振蕩混勻10 min。自動酶標儀檢測A490吸光值。根據(jù)下列公式計算rAd/5-Fc對腫瘤細胞的生長抑制率：

1.2.6 血管內(nèi)皮細胞抑制試驗 用0.02%EDTA消化生長良好的ECV-304細胞為單個細胞，用1640培養(yǎng)液（含有ECGF 5 mg/L）稀釋成2×108細胞/L，接種于96孔板。第1列加培養(yǎng)液，其余各孔加細胞液0.2 mL，37℃5%CO2培養(yǎng)為單層。吸棄液體，空白對照（第1列）和細胞對照（第2列）加培養(yǎng)液，自第3列后分別加入上述培養(yǎng)液稀釋為25%的rAd-CD和rAd-CDglyES細胞培養(yǎng)上清液的濃縮液及后者的未濃縮液，各接種3列，每孔0.2mL，37℃5%CO2培養(yǎng)68 h。每孔加20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄液體，每孔加DMSO 200 μL，振蕩混勻10 min。自動酶標儀測A570吸光值。依據(jù)下列公式計算細胞生長抑制率：

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 酶切鑒定構(gòu)建的pAdTrackCMV-CD質(zhì)粒

經(jīng)雙酶切后電泳可見特異性條帶9.2 kb和1.3 kb（圖1），證實CD基因的正確插入。

2.2 雙酶切鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒pAdTrackCMV-CDglyES

經(jīng)雙酶切后電泳可見特異性條帶9.2 kb和1.9 kb（圖2），1.9 kb符合CDglyES大小，證實ES基因的正確插入。

2.3 PCR鑒定同源重組的prAdCDglyES

分別用CD上游引物和ES下游引物、CD上下游引物及ES上下游引物進行PCR擴增，獲取3條特異條帶1.9 kb、1.3 kb和0.58 kb（圖3）。證實成功同源重組。

2.4 計算重組腺病毒rAdCDglyES的滴度

293細胞上清液中rAdCDglyES的滴度是1×1010TCID50/L；純化后 rAdCDglyES的滴度是 1×1013.3TCID50/L。

2.5 重組腺病毒rAdCDglyES／5-FC系統(tǒng)對SKOV-3細胞生長的抑制作用。

經(jīng)rAdCDglyES/5-FC系統(tǒng)處理的正常SKOV-3細胞，可見細胞變圓，細胞病變明顯；而未經(jīng)rAdCDglyES/5-FC系統(tǒng)處理的正常SKOV-3細胞，細胞生長狀態(tài)良好，呈典型“鵝卵石樣”緊密排列（圖4）。重組腺病毒報告基因GFP在SKOV-3細胞中表達，說明該病毒成功轉(zhuǎn)染腫瘤；正常SKOV3細胞無GFP的表達（圖5）。經(jīng)方差分析，各組吸光度數(shù)值的差異有統(tǒng)計學意義（F=366.534，P＜0.01）。rAdCDgly-ES組與rAd-acZ組及rAd-CD比較均有顯著性差異（P＜0.01）。3種重組病毒對瘤細胞SKOV-3均有一定程度的抑制作用，rAdCDglyES組對卵巢癌細胞SKOV-3的生長抑制率為83.1%，rAd-CD組和rAd-acZ組分別為70.6%和24.1%，rAdCDglyES組和rAd-CD組對腫瘤細胞抑制率均明顯高于rAdLacZ組，且其差異均具顯著性（P＜0.01）；比較rAdCDglyES與rAd-CD對腫瘤細胞的抑制也有顯著性差異（P＜0.01，表1）。

圖1 pAdTrackCMV-CD酶切電泳圖Figure 1 pAdTrackCMV-CD restriction enzyme cutting electrophoresis

圖2 pAdTrackCMV-CDglyES雙酶切電泳圖Figure 2 pAdTrackCMV-CDglyES restriction enzyme cutting electrophoresis

圖3 PCR鑒定重組腺病毒prAdCDglyESFigure 3 Recombinant adenovirus prAdCDglyES identified via PCR

圖4 rAdCDglyES/5-FC系統(tǒng)處理的SKOV-3細胞 （H&E×400）Figure 4 rAdCDglyES/5-FC processing SKOV-3 cell（H&E×400）

圖5 SKOV-3細胞中重組腺病毒報告基因GFP的表達 （H&E×400）Figure 5 Expression of the recombinant adenovirus report gene GFP in SKOV-3 cell（H&E×400）

表1 rAd-LacZ、rAd-CD、及rAdCDglyES對SKOV-3細胞生長的抑制作用 （±s）%Table 1 Inhibition of rAd-LacZ,rAd-CD,and rAdCDglyES on proliferation of SKOV-3（±s）%

表1 rAd-LacZ、rAd-CD、及rAdCDglyES對SKOV-3細胞生長的抑制作用 （±s）%Table 1 Inhibition of rAd-LacZ,rAd-CD,and rAdCDglyES on proliferation of SKOV-3（±s）%

Groups n Cell inhibition rate（±s）% P 32 30 30 24.1±13.2* 70.6±5.8* 83.1±6.3* 0.01 rAd-acZ①rAd-CD②rAdCDglyES③①The culture supernatant from cells transfected rAd-acZ；②The culture supernatant from cells transfected rAdCD；③The culture supernatant from cells transfected rAdCDglyES（experiment group）；*P＜0.01

2.6 rAd-CDglyES細胞培養(yǎng)上清對內(nèi)皮細胞ECV-304的影響

研究表明rAd-CD和rAdCDglyES 2種重組腺病毒表達產(chǎn)物不同程度地影響ECGF處理的ECV-304內(nèi)皮細胞的增殖。經(jīng)方差分析，各組吸光度值的差別有統(tǒng)計學意義（F=107.217，P＜0.01）。rAdCDglyES濃縮組與rAdCDglyES未濃縮組及rAd-CD濃縮組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。3種重組病毒對內(nèi)皮細胞ECV-304均有一定程度的抑制作用，rAdCDgly-ES濃縮組對內(nèi)皮細胞ECV-304的生長抑制率為78.7%，rAdCDglyES未濃縮組及rAd-CD濃縮組分別為27.8%和23.9%，rAdCDglyES濃縮組對ECV-304細胞的抑制率明顯高于同樣濃縮的rAd-CD組和未濃縮rAdCDglyES組，且其差異均具顯著性（P＜0.01）；比較 rAdCDglyES未濃縮組與 rAd-CD濃縮組對ECV-304細胞的抑制無顯著性差異（表2）。

表2 rAd-CD和rADCDglyES細胞培養(yǎng)上清對ECV-304細胞生長的抑制作用 （±s）%Table 2 Inhibition of culture supernatant from cells transfected with rAd-CD and rAdCDg lyES on proliferation of ECV-304（±s）%

表2 rAd-CD和rADCDglyES細胞培養(yǎng)上清對ECV-304細胞生長的抑制作用 （±s）%Table 2 Inhibition of culture supernatant from cells transfected with rAd-CD and rAdCDg lyES on proliferation of ECV-304（±s）%

Cell inhibition rate（±s）% Groups n P rAd-CD(concentrated)①rAdCDglyES②rAdCDglyES(concentrated)③①The concentrated culture supernatant from cells transfected with rAd-CD（control group）；②The nonconcentrated culture supernatant from cells transfected with rAdCDglyES；③The concentrated culture supernatant from cells transfected with rAdCDglyES（experimental group）；*P＜0.01 10 10 10 23.9±9.7* 27.8±5.3* 78.7±1.6 0.01 0.01

3 討論

自2000年基因治療成功治療遺傳性疾?。?］至今，基因治療已成為腫瘤治療研究中一個重要方向。盡管腫瘤基因治療在實驗室內(nèi)取得了很好的效果，部分已進入Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗，但是應(yīng)用于臨床還有距離［6，10-11］。一些學者認為［5］其可能與以下因素相關(guān)：1）所有治療方案中大多數(shù)只插入了單個目的基因；2）載體缺乏靶向性；3）載體轉(zhuǎn)染效率、安全性和插入外源基因容量等問題。鑒于此，本研究構(gòu)建了含CD和ES的融合基因重組腺病毒rAdCDglyES，并證實了CD和ES基因的正確切入。

本研究選用的載體是腺病毒5型（Ad5），目前腺病毒載體與腫瘤基因治療臨床實驗所用載體的23.3%，其臨床應(yīng)用的可行性和安全性已獲公認，生物學優(yōu)勢和臨床應(yīng)用優(yōu)勢突出［12］。較其他病毒載體相比腺病毒載體更易于培養(yǎng)及純化、重組后其理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，宿主范圍廣，載體容量大，轉(zhuǎn)染率高，基因表達的能力強［10］，而且病毒DNA一般存在于細胞染色體外，整合突變致癌的可能性小。本研究選用了CD自殺基因做為融合基因之一，通過CD基因表達胞嘧啶脫氨酶使5-FC轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU直接殺傷瘤細胞［7］。CD基因已被開發(fā)用于基因治療腫瘤［13-14］。O'Reilly等［8］報道內(nèi)皮抑素可抑制內(nèi)皮細胞生長遷移，并可抑制血管生成。在多種腫瘤中均可抑制其血管生成［14］，包括卵巢癌［15］。腺病毒載體可確保延長內(nèi)皮抑素的表達［16］。本研究選用ES基因作為融合基因的另一基因。不同的腫瘤細胞對不同酶或前藥體系的敏感性不同，腫瘤患者體內(nèi)常同時存在多種克隆腫瘤細胞，采用單一酶或前藥體系難以達到預(yù)想療效，可采用聯(lián)合多個基因的途徑提高療效。因此本研究將CD和ES基因融合插入腺病毒載體，構(gòu)建直接、間接雙重殺傷瘤細胞的重組腺病毒rAd-Cdgly-ES，觀察其對腫瘤細胞的影響。

本研究將rAdCDglyES轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞，24 h細胞后無明顯改變，熒光顯微鏡下可見大部分細胞呈綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染rAdCDglyES的瘤細胞中的重組腺病毒載體攜帶的GFP基因表達了綠色熒光蛋白，以此監(jiān)察轉(zhuǎn)染是否成功，比觀察CPE早而方便。前藥5-FC作用48h后可見病變的細胞。rAdCDglyES和rAd-CD分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞SKOV-3的生長抑制率與rAd-LacZ組比均有顯著性差異，說明rAdCDglyES轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞后融合基因表達產(chǎn)物與rAd-CD一樣表達胞嘧啶脫氨酶，使5-FC轉(zhuǎn)化成5-FU對該細胞的生長有抑制作用。結(jié)果還顯示rAdCDglyES表達產(chǎn)物也影響經(jīng)ECGF處理的ECV-304細胞增殖。當rAdCDglyES表達產(chǎn)物10倍濃縮后其抑制率明顯高于同樣濃縮的rAd-CD表達產(chǎn)物抑制率，證實了rAdCDglyES中的ES基因活性未受影響，表達了內(nèi)皮抑素，抑制ECGF處理后的內(nèi)皮細胞的增殖。而未濃縮的rAdCDglyES表達產(chǎn)物對ECV-304細胞生長的抑制率與對照相比差異不顯著，說明可能需要調(diào)整病毒的濃度才能保證對ECGF處理后的內(nèi)皮細胞增殖發(fā)揮較強的抑制作用。

含CDglyES雙基因的重組腺病毒是在國內(nèi)外首次構(gòu)建，并獲得發(fā)明專利（證書號：第226769）。本研究通過體外試驗證實了該重組體抑制人卵巢癌細胞（直接抑瘤作用）和血管內(nèi)皮細胞的增殖（即對腫瘤的間接抑制作用）。后續(xù)將進一步深入研究rAdCDglyES體內(nèi)外對人卵巢癌的影響，如體外繼續(xù)摸索重組病毒和前藥用量的合理配伍以達到最佳抑瘤作用、觀察動物模型的體內(nèi)抑瘤作用和病毒、藥物配伍條件以及放、化療的協(xié)同作用方面的研究等。

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（2013-12-11收稿）（2014-05-10修回）

（本文編輯：周曉穎）

Gene therapy of human ovarian carcinomain vitro

Pu LI1,2,Dongtian LI3,Bingnan YIN3,Hua TANG3,Lirong YIN2
Correspondence to:Lirong YIN;E-mail:yinLiRongfk@sina.com

Objective:To construct a recombinant adenovirus containing CDglyES fusion gene,which can directly inhibit human ovarian cancer cell and indirectly inhibit vascular endothelial cell growth.Methods:We constructed prAdCDglyES using a homologous recombination method in bacteria.The prAdCDglyES was transfected to 293 packaging cells using liposome,in which rAdCDgly-ES was packaged and amplified.MTT was used to observe the proliferation inhibition effect of rAdCDglyES on human ovarian cancer cells and the growth inhibition effect of expressing products of rAdCDglyES on ECV-304.Results:The titer of rAdCDglyES was 1× 1013.3TCID50/L,whereas the inhibition rate on human ovarian cancer cell SKOV-3 was(83.1±6.3)%.This result is significantly different from the control rAd-LacZ,which had an inhibition rate of(24.1±13.2)%(P＜0.01).The concentrated culture supernatant from cells transfected with rAdCDglyES can inhibit ECV-304 cell proliferation at a rate of(78.7±1.6)%.This rate is significantly different compared with that of the control with the same concentration of culture supernatant from cells transfected with rAd-CD,with an effect on ECV-304 cell shown by an inhibition rate of(23.9±9.7)%(P＜0.01).Conclusion:The results showed that the recombinant adenovirus rAdCDglyES could inhibit human ovarian cancer cells directly and indirectly.

human ovarian cancer,cytidine deaminase,endostadine,adenovirus,gene therapy

10.3969/j.issn.1000-8179.20140756

李圃 碩士研究生，主治醫(yī)師。研究方向為婦科和婦科腫瘤。

①天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院腫瘤科（天津市300100）；②天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；③天津醫(yī)科大學微生物學教研室

尹利榮 yinLiRongfk@sina.com

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