重組人源SNX7蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及磷脂結(jié)合特異性分析

馮站，許婷婷，徐進新

1安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230601

2中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州510530

圖2融合PX-BARSNX7蛋白在大腸桿菌Rosseta 2 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測結(jié)果

Fig.2SDS-PAGE result of the expression of the recombinant humanPX-BARSNX7 in E.coli Rosseta2 (DE 3)at 16℃.M:protein molecular weight standard; 1:total protein before IPTG induction;2:total protein after IPTG induction;3:pellet fraction;4:soluble fraction.

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

重組人源SNX7蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及磷脂結(jié)合特異性分析

馮站1,2，許婷婷2，徐進新2

1安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230601

2中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州510530

馮站,許婷婷,徐進新.重組人源SNX7蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及磷脂結(jié)合特異性分析.生物工程學(xué)報,2014, 30(9):1436?1445.

Feng Z,Xu TT,Xu JX.Expression,purification and phosphoinositide binding specifity of recombinant human SNX7 expressed in Escherichia coli.Chin J Biotech,2014,30(9):1436?1445.

Sorting nexins(SNXs)是一類含有SNX-PX結(jié)構(gòu)域，并在細(xì)胞內(nèi)吞和內(nèi)體分選運輸過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的蛋白。SNX7是SNXs家族中的一員，含有PX結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域，屬于SNX-PX-BAR亞家族。斑馬魚實驗表明，SNX7是在肝臟中大量表達(dá)的抗凋亡蛋白，并在胚胎肝臟的發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了從蛋白水平對SNX7進行研究，首先將編碼人源PX-BARSNX7(SNX7的一個片段，包含PX和BAR結(jié)構(gòu)域)的cDNA片段插入到原核表達(dá)載體p28a中，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosseta 2(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，并用親和層析、離子交換和分子篩層析對PX-BARSNX7進行了純化。Western blotting結(jié)果表明，親和層析、離子交換和分子篩層析純化后獲得了高純度的PX-BARSNX7蛋白。動態(tài)光散射實驗顯示PX-BARSNX7蛋白均一性良好。磷脂結(jié)合實驗表明，PX-BARSNX7具有較為廣泛的磷脂酰肌醇結(jié)合能力，能夠與PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2和PtdIns(3,4,5)P3結(jié)合。

Sorting nexin 7(SNX7)，磷脂結(jié)合，均一性，表達(dá)純化

Sorting nexins(SNXs)是一類含有PX結(jié)構(gòu)域，并在細(xì)胞內(nèi)吞和蛋白分選運輸?shù)燃?xì)胞過程中發(fā)揮重要作用的蛋白[1-5]。PX結(jié)構(gòu)域特異性地與磷脂酰肌醇結(jié)合，并介導(dǎo)SNXs靶向富含特異磷脂酰肌醇的細(xì)胞器。根據(jù)結(jié)構(gòu)域組成，目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的33種SNXs可以分為3大類：SNX-PX,這類SNXs只含有PX結(jié)構(gòu)域和側(cè)翼序列，包括SNX3、SNX10、SNX11、SNX12、SNX22和SNX24；SNX-PX-BAR，這類SNXs含有PX結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域，包括SNX1、SNX2、SNX4、SNX5、SNX6、SNX7、SNX8、SNX9、SNX18、SNX30、SNX32和SNX33；SNX-PX-other，這類SNXs除了含有PX結(jié)構(gòu)域外，還含有除了BAR結(jié)構(gòu)域外的其他結(jié)構(gòu)域[3]。

在SNXs蛋白中，SNX-PX-BAR的功能研究較多，它們被認(rèn)為在內(nèi)體的分選運輸中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。SNX1、SNX2、SNX5和SNX6組成retromer的膜結(jié)合亞復(fù)合物，調(diào)節(jié)陽離子非依賴性的甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)由內(nèi)體向高爾基體的逆向運輸[6-11]。SNX4參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfnR)由內(nèi)體向質(zhì)膜的循環(huán)轉(zhuǎn)運[12]。SNX9、SNX18和SNX33除了含有PX結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域，還有SH3結(jié)構(gòu)域，它們在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用中發(fā)揮重要作用。SNX9和SNX18的表達(dá)沉默會抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的吸收[13-14]，而SNX33的表達(dá)將抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的吸收[15]。此外，SNX9通過結(jié)合WASP還能調(diào)節(jié)T細(xì)胞信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)肌動蛋白依賴性的液相內(nèi)吞[16]。最近，舒曉東等以斑馬魚為模式動物，對SNX7的生物功能進行了初步的研究。他們發(fā)現(xiàn)SNX7是在肝臟中大量表達(dá)的抗凋亡蛋白，是斑馬魚胚胎發(fā)育早期肝母細(xì)胞的生存所必需的[17]。

SNX7屬于SNX-PX-BAR亞家族，包含N端的PX結(jié)構(gòu)域和C端的BAR結(jié)構(gòu)域。為了從蛋白水平對SNX7進行研究，并為SNX7的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究建立基礎(chǔ)，我們對SNX7的一個片段PX-BARSNX7(包含PX結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域)進行了表達(dá)、純化和磷脂酰肌醇結(jié)合特異性分析。我們成功地在大腸桿菌中表達(dá)了可溶的PX-BARSNX7蛋白。我們用親和層析、離子交換和分子篩層析對PX-BARSNX7進行了純化，并獲得了高純度的蛋白。磷脂結(jié)合實驗表明，PX-BARSNX7能結(jié)合多種磷脂酰肌醇：PtdIns(4)P、PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2以及PtdIns(3,4,5)P3。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株Rosseta 2(DE3)，質(zhì)粒p28a均由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)周叢照實驗室贈送；插入人源snx7(isoform b，序列號：EAW72996.1)cDNA的PCR3.1-snx7質(zhì)粒由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院(GIBH)裴端卿實驗室贈送。

鎳親和層析柱購于Qiagen公司。離子交換柱(QFF)、分子篩層析柱HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade、AKTA purifier純化系統(tǒng)均購于GE healthcare公司。蛋白電泳儀、Model 550酶標(biāo)儀購于Bio-Rad公司。動態(tài)光散射儀The DynaPro TITAN購自Wyatt Technology公司。普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購于TIANGEN公司。一抗(His鼠單抗)購于Qiagen公司，二抗(羊抗鼠)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ均購于TaKaRa公司。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購于Amresco公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 人源重組PX-BARSNX7片段表達(dá)載體的構(gòu)建

用分子克隆的方法將編碼人源PX-BARSNX7 (氨基酸殘基從25–384)的cDNA片段插入到p28a載體中。首先用PCR擴增出目的DNA片段，目的DNA片段的理論大小為1 101 bp，PCR引物如下：5′-CCGCATATGGATGAACCAGATTTAA AGGA-3′，5′-TGGCTCGAGTCATTCAGAGGCT TCTTCCAAGTGAA-3′。PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，5個循環(huán)；98℃變性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，25個循環(huán)；72℃延伸5 min。再將p28a載體和PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進行酶切。最后，將雙酶切后的PCR產(chǎn)物連接到p28a載體上，把構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10，涂板后，置于37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，菌落PCR使用載體上的通用引物(5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′；5′-GCTAG TTATTGCTCAGCGG-3′)。菌落PCR產(chǎn)物的理論大小約為1 301 bp。提取陽性質(zhì)粒，并進行DNA測序驗證，測序驗證無誤后，用于下一步實驗。

1.2.2 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的表達(dá)

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒p28a-px-barsnx7轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosseta 2(DE3)，涂板后于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)14–16 h。挑取單克隆接種于含有氯霉素和氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12–14 h，按照1%的體積轉(zhuǎn)移到含有500 mL LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37℃培養(yǎng)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.6–0.8時，加入終濃度為0.6 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h。離心收集菌體，于–30℃保存。

1.2.3 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的純化

將收集保存的菌體放于冰上解凍，用裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，5%甘油，7 mmol/L β-巰基乙醇，10 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF)重懸菌體。用低溫高壓破碎的方法充分破碎菌體，12 000 r/min離心30 min，分別取沉淀和上清液進行SDS-PAGE電泳檢測。上清液經(jīng)過超濾后用鎳親和層析柱進行親和純化。鎳親和層析柱用10個柱體積的結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl,5%甘油，7 mmol/L β-巰基乙醇，10 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF)平衡后上樣。然后用洗滌蛋白緩沖液(咪唑濃度分別為20 mmol/L和40 mmol/L)充分洗滌除去鎳柱中非特異性結(jié)合在柱子上的雜蛋白，分別收集洗滌蛋白液。最后用5個柱體積的蛋白洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，5%甘油，7 mmol/L β-巰基乙醇，250 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF)特異性洗脫目的蛋白，收集洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測。鎳親和層析純化收集的洗脫蛋白液超濾后再用離子交換柱(QFF)繼續(xù)純化，首先用離子交換緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，7 mmol/L β-巰基乙醇)平衡柱子，上樣后用含有高濃度NaCl的緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，1 mol/L NaCl，7 mmol/L β-巰基乙醇)進行梯度洗脫，收集蛋白，并進行SDS-PAGE電泳檢測。最后將蛋白收集液超濾濃縮后，用分子篩(Superdex 200 16/60)純化，分子篩緩沖液成分是20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5(4℃)，300 mmol/L NaCl，5%甘油，5 mmol/L DTT，收集出峰位置的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測。把樣品混合濃縮后用Bradford法測定其蛋白濃度。

1.2.4 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的Western blotting分析

分子篩純化的蛋白進行SDS-PAGE后，用電轉(zhuǎn)儀將所測蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用脫脂奶粉封閉過夜，與鼠抗組氨酸標(biāo)簽的單抗室溫孵育1 h，再與羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，ECL顯色，最后壓片曝光。

1.2.5 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的動態(tài)光散射實驗

動態(tài)光散射儀能通過測量樣品散射光強度起伏的變化得出樣品中顆粒大小的信息。根據(jù)散射光強度的變化，測得溶液中分子的擴散系數(shù)D，經(jīng)公式：D=KT/6πηR可求出分子的流體動力學(xué)半徑R(式中K為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，η為溶液的粘滯系數(shù))。結(jié)合光強(Mass)、多分散性(Polydispersity，Pd)和R指標(biāo)可以分析蛋白溶液中顆粒大小的均一性。

1.2.6 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的磷脂結(jié)合檢測

磷脂結(jié)合實驗采用Protein-Lipid Overlay Assay方法，實驗參照文獻中的步驟進行[18]。從Echelon Biosciences公司購得醋酸纖維膜(PIP Strips，貨號：P-6001)上有多種磷脂斑點。該膜用含有3%牛血清蛋白的PBS-T緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.1%(V/V) Tween-20)在室溫下孵育1 h，然后放入含有1 μg/mL的人源重組融合蛋白PX-BARSNX7在緩沖液中孵育1 h。用PBS-T緩沖液洗滌6次，每次5 min。為了檢測被結(jié)合在膜上的蛋白，將膜在含有抗組氨酸標(biāo)簽抗體的溶液中孵育1 h，洗滌6次，每次5 min。再置于羊抗鼠二抗的緩沖液中，室溫孵育1 h，充分結(jié)合后，再次洗滌，最后在膠片上曝光，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 p28a-px-barsnx7片段表達(dá)載體的構(gòu)建

本實驗采用的p28a載體是在pET28a的基礎(chǔ)上進行了改造的載體，去除了His標(biāo)簽和NdeⅠ酶切位點之間的序列。PCR反應(yīng)獲得的px-barsnx7片段經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后插入到經(jīng)同樣酶切處理的p28a載體中。利用載體上的通用引物進行菌落PCR篩選重組載體，菌落PCR產(chǎn)物的理論大小約為1 301 bp(圖1)。將陽性質(zhì)粒進行測序驗證。

2.2 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的表達(dá)

圖1 重組質(zhì)粒p28a-px-barsnx7的菌落PCR鑒定圖譜Fig.1Identificationofrecombinantplasmid p28a-px-barsnx7.1:DNA molecular weight standard (DL 2000);2:PCR product.

將質(zhì)粒p28a-px-barsnx7成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosseta 2(DE3)，經(jīng)37℃培養(yǎng)的菌液的OD600達(dá)到0.6–0.8時，加入終濃度為0.6 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在16℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，收集菌體，并進行SDS-PAGE電泳檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，IPTG誘導(dǎo)之后在44 kDa附近有一條明顯的蛋白條帶，與重組融合蛋白His-PX-BARSNX7的分子量(43.9 kDa)基本相當(dāng)(圖2)。菌體經(jīng)高壓破碎后離心，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，部分PX-BARSNX7以可溶的形式表達(dá)于上清中(圖2)。

2.3 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的純化及Western blotting檢測結(jié)果

人源重組融合蛋白PX-BARSNX7是氨基端帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，我們首先用鎳親和柱純化PX-BARSNX7。上樣后PX-BARSNX7與鎳充分結(jié)合，再依次用含有40 mmol/L咪唑和250 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白。收集洗脫的蛋白，并進行SDS-PAGE檢測。SDS-PAGE電泳檢測顯示，大部分的目的蛋白都被含有250 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫(圖3)。

圖1 重組質(zhì)粒p28a-px-barsnx7的菌落PCR鑒定圖譜Fig.1Identificationofrecombinantplasmid p28a-px-barsnx7.1:DNA molecular weight standard (DL 2000);2:PCR product.

圖2融合PX-BARSNX7蛋白在大腸桿菌Rosseta 2 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測結(jié)果

Fig.2SDS-PAGE result of the expression of the recombinant humanPX-BARSNX7 in E.coli Rosseta2 (DE 3)at 16℃.M:protein molecular weight standard; 1:total protein before IPTG induction;2:total protein after IPTG induction;3:pellet fraction;4:soluble fraction.

再將經(jīng)鎳親和柱純化后的蛋白用離子交換柱(QFF)進行進一步純化，如圖4A所示，在離子交換純化過程中出現(xiàn)了3個蛋白洗脫峰(P1、P2和P3)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示大部分目的蛋白出現(xiàn)在峰P2中(圖4B)。

將離子交換純化后的蛋白再用分子篩層析純化，結(jié)果如圖5A所示，在77.26 mL位置處出現(xiàn)蛋白洗脫峰，峰形較好，收集峰處蛋白樣品，并進行SDS-PAGE電泳檢測。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，PX-BARSNX7蛋白的純度達(dá)到95%以上(圖5B)。最后，將純化后的蛋白進行Western blotting檢測(圖6)。

圖3 融合蛋白PX-BARSNX7鎳柱純化SDS-PAGE檢測Fig.3SDS-PAGE result of the purified recombinant humanPX-BARSNX7 by Ni column.M:protein molecular weight standard;1:elution fraction by 40 mmol/L imidazole;2:elution fraction by 250 mmol/L imidazole.

圖4 融合蛋白PX-BARSNX7離子交換純化的(QFF)AKTA色譜圖(A)及SDS-PAGE檢測圖(B)Fig.4(A)The ion exchange chromatography of the purified recombinant humanPX-BARSNX7.(B)SDS-PAGE result of the purified recombinant humanPX-BARSNX7 by ion exchange.M:protein molecular weight standard;C:PX-BARSNX7 before loading on the ion exchange column;FT:flow through;P1:the first peak;P2:the second peak;P3: the third peak.

圖5 融合蛋白PX-BARSNX7分子篩純化的AKTA色譜圖(A)及SDS-PAGE檢測圖(B)Fig.5(A)The gel filtration chromatogram of the purified recombinant humanPX-BARSNX7.(B)SDS-PAGE result of the purified recombinant humanPX-BARSNX7 by gel filtration.M:protein molecular weight standard;1:purified recombinant humanPX-BARSNX7.

圖6 融合蛋白PX-BARSNX7的Western blotting檢測Fig.6Western blotting of recombinant humanPX-BARSNX7. M:proteinmolecularweightstandard;1:purified recombinant humanPX-BARSNX7.

2.4 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7的均一性檢測

為了檢測PX-BARSNX7在溶液中的狀態(tài)，將分子篩純化的蛋白用動態(tài)光散射分析。動態(tài)光散射結(jié)果顯示：蛋白溶液中100%Mass的散射光均來自R為5.7 nm的顆粒物質(zhì)。Pd＜15%，說明顆粒物質(zhì)存在形式單一，具有良好的均一性(圖7)。這些指標(biāo)都說明，經(jīng)過純化，人源重組融合蛋白PX-BARSNX7可以達(dá)到良好的均一性。

2.5 人源重組融合蛋白PX-BARSNX7與磷脂結(jié)合特異性分析

PX結(jié)構(gòu)域具有特異性地與磷脂酰肌醇結(jié)合的能力。為了檢測PX-BARSNX7是否也具有磷脂酰肌醇結(jié)合的能力以及磷脂結(jié)合的特異性，我們將PX-BARSNX7進行了磷脂結(jié)合實驗。如圖8所示，融合蛋白PX-BARSNX7能結(jié)合PtdIns(4)P、PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2、PI(3,4,5)P3。其中，

圖7 融合蛋白PX-BARSNX7動態(tài)光散射結(jié)果(R：流體動力學(xué)半徑；%Mass：質(zhì)量分?jǐn)?shù))Fig.7Dynamiclightscattering(DLS)sized distribution result of the purified recombinant humanPX-BARSNX7.R:hydrodynamic radius;%Mass:mass fraction.

圖8 融合蛋白PX-BARSNX7的膜脂結(jié)合檢測Fig.8Protein-Lipid Overlay Assay of recombinant humanPX-BARSNX7.

與PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2、PtdIns(3,4,5)P3相互作用較強，而和PtdIns(4)P的作用相對較弱。這表明PX-BARSNX7具有較為廣泛的磷脂結(jié)合能力，能結(jié)合多種磷脂酰肌醇。

3 討論

SNX-PX-BAR是在細(xì)胞內(nèi)吞和蛋白分選運輸中發(fā)揮重要作用的蛋白，具有兩個可以與膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)域：PX結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域。PX結(jié)構(gòu)域特異性地與磷脂酰肌醇結(jié)合[19]。BAR結(jié)構(gòu)域可以感應(yīng)膜的曲率或誘導(dǎo)膜的彎曲，在膜的重塑中發(fā)揮重要作用[2,20-21]。

不同SNX-PX-BAR蛋白與磷脂酰肌醇的結(jié)合能力不同。SNX1可以結(jié)合PtdIns(3)P和PtdIns(3,5)P2[22]；SNX2結(jié)合PtdIns(3)P[23]；SNX9可以結(jié)合PtdIns(3)P、PtdIns(3,4)P2、PtdIns(4,5)P2和PtdIns(3,4,5)P3[24]；SNX18可以結(jié)合PtdIns(3,4)P2和PtdIns(4,5)P2[25]。我們首次對SNX7的磷脂酰肌醇結(jié)合能力進行了研究。Protein-Lipid Overlay Assay實驗表明，與SNX9類似，SNX7也具有較為廣泛的磷脂酰肌醇結(jié)合能力，能結(jié)合多種磷脂酰肌醇。其中，SNX7與PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2和PtdIns(3,4,5)P3的結(jié)合能力相對較強，與PtdIns(4)P的結(jié)合能力較弱。

目前，SNX7的研究才剛剛起步。揭示SNX7的功能及其機制，還需要更多的細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。SNX7的PX結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)雖然已被解析，但尚缺乏PX-BARSNX7(包括PX結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域的SNX7片段)或SNX7全長的結(jié)構(gòu)。

本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)了PX-BARSNX7蛋白。通過鎳柱親和層析、離子交換和分子篩純化，獲得純度大于95%的PX-BARSNX7蛋白。動態(tài)光散射實驗表明，純化后的PX-BARSNX7蛋白在溶液中的狀態(tài)是較為均一的。這些研究為PX-BARSNX7蛋白的結(jié)構(gòu)研究奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Expression,purification and phosphoinositide binding specifity of recombinant human SNX7 expressed in Escherichia coli

Zhan Feng1,2,Tingting Xu2,and Jinxin Xu2
1 School of Life Science,Anhui University,Hefei 230601,Anhui,China
2 Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health,Chinese Academy of Sciences(GIBH),Guangzhou 510530,Guangdong,China

Sorting nexins(SNXs)are a large group of proteins that contain Phox(PX)domain and involve in regulating endocytosis and endosome sorting.SNX7,a member of SNXs family,contains a PX domain and a BAR domain.In zebrafish,SNX7 is a liver-enriched anti-apoptotic protein and indispensible for the liver development.A fragment of SNX7 cDNA(px-barsnx7),encoding the PX domain and the BAR domain,was inserted into the expressing vector p28a,transformed into E.coli Rosseta 2(DE3),and then induced by isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside(IPTG).After affinity,ion exchange and gel filtration purification,the purity ofPX-BARSNX7 reached over 95%.Dynamic light scattering(DLS) experiment indicated thatPX-BARSNX7 was homogeneous in solution.Lipid overlay assay showed thatPX-BARSNX7 can bind to PtdIns(5)P,PtdIns(4,5)P2and PtdIns(3,4,5)P3.

Sorting nexin 7(SNX7),lipid overlay assay,homogeneity,expression and purification

November 25,2013;Accepted:February 11,2014

Jinxin Xu.Tel:+86-20-32015240;E-mail:xu_jinxin@gibh.ac.cn

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2012CB917200).

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2012CB917200)資助。

時間：2014-03-10網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130600.html