N端測序作為單克隆抗體常規(guī)放行分析方法的探討

郭瑋，于傳飛，李萌，王蘭，張峰，劉春雨，王文波，高凱

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

單克隆抗體的發(fā)展經(jīng)歷了鼠源、嵌合、人源化和全人源 4個階段，由于鼠源和嵌合單抗會產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)，所以人源化和全人源單抗已成為生物技術(shù)企業(yè)研發(fā)的主流[1-4]。單抗的分子量高達 150 kDa左右，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其質(zhì)控相比較于小分子藥物要求較高?！吨腥A人民共和國藥典》[5]尚未納入單抗藥物的總論和各論，國內(nèi)的生物技術(shù)企業(yè)仍參照其他重組藥物的規(guī)定對單抗進行質(zhì)控，但是人源化和全人源單抗作為一大類分子具有其獨特的序列結(jié)構(gòu)特征，本文將針對鑒別實驗中的N端測序是否應(yīng)納入常規(guī)放行質(zhì)控方法進行探討，為生物技術(shù)企業(yè)的對單抗的質(zhì)控提供參考。

人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議 (The International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)中 Q6B章節(jié)建議鑒別實驗應(yīng)具有高度特異性，其設(shè)計應(yīng)基于分子結(jié)構(gòu)或其他性質(zhì)的獨特性[6]。單克隆抗體結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，但具有結(jié)構(gòu)共性，其特異性識別相應(yīng)靶抗原的基礎(chǔ)在于其抗原結(jié)合片斷(Antigen-binding fragment，F(xiàn)ab)上互補決定區(qū)(Complementarity-determining region，CDR)氨基酸序列的不同，而對于人源化和全人源單抗而言，其他序列則有很大可能性具有相同或高度相似性[7]，這就對其鑒別實驗提出了巨大挑戰(zhàn)。

本研究通過多種理化分析技術(shù)，包括N端測序 (Edman降解法、液質(zhì)聯(lián)用法)、質(zhì)量肽圖法、離子交換色譜、毛細管區(qū)帶電泳[8]、成像毛細管等點聚焦電泳[9]，對兩種單抗即抗 HER2(人表皮生長因子受體 2，human epidermal growth factor receptor-2)單抗和抗VEGF (血管內(nèi)皮生長因子，vascular endothelial growth factor)單抗進行了綜合分析，對這些方法作為常規(guī)放行分析方法及鑒別方法的適用性進行了探討。

1 材料與方法

1.1 樣品

抗體1為抗HER2單抗，抗體2為抗VEGF單抗，二者均為人源化的IgG1/kappa型單抗，由中國倉鼠卵巢 (Chinese hamster ovary，CHO)細胞表達，二者均為本室留樣。

1.2 主要儀器及試劑

電泳儀和電轉(zhuǎn)儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；N末端氨基酸序列分析儀為美國ABI公司產(chǎn)品，型號為PROCISE 491，附帶The Model 610 A工作站；超高效液相為 Waters公司的 ACQUITY UPLC H-Class Bio System，色譜柱為BEH130 C18分析柱，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；質(zhì)譜為Waters公司的Xevo G2 QTOF，分析軟件為Waters公司的Biopharmalynx；高效液相為Waters公司的Waters Alliance，色譜柱為Dionex ProPac WCX-10, 4.0 mm×250 mm；毛細管電泳系統(tǒng)為Beckman公司的PA800 plus系統(tǒng)；成像毛細管等點聚焦電泳系統(tǒng)為ProteinSimple公司的iCE280。

2×Tris-Glycine SDS 上樣緩沖液 (貨號LC2676)、4%?20%梯度分離膠 (貨號 EC6025)和電泳緩沖液 (貨號NP0001)均購自Novex；PVDF膜購自Pall公司，貨號66543；8 mol/L鹽酸胍 (貨號 G9284)、二硫蘇糖醇 (DTT，貨號 D0632)和碘乙酸鈉 (貨號I2512)均購自Sigma公司；胰蛋白酶購自Promega公司，貨號為V5111。CpB (羧肽酶 B)購自 Roche公司，貨號為 103233；Beckman eCAP N-CHO涂層毛細管購自Beckman Coulter公司；1%甲基纖維素溶液、pI marker 7.55和 10.10以及毛細管購自 ProteinSimple公司；Pharmalyte pH 3?10和pH 8?10.5購自GE公司。

1.3 方法

1.3.1 Edman降解法分析 N末端氨基酸實驗步驟

將樣品用去離子水稀釋至 2 mg/mL，進行電泳轉(zhuǎn)膜以及測序，具體實驗步驟按照文獻所示方法進行[10]。

1.3.2 肽圖及液質(zhì)聯(lián)用分析N末端實驗步驟

將1 mg抗體蛋白加入到750 mL 8 mol/L鹽酸胍中，同時加入 1 mol/L DTT至終濃度為60 mol/L，混勻，37 ℃孵育60 min。取2.9 mol/L的碘乙酸鈉45 mL，加入到上述緩沖液中，混勻，室溫避光孵育45 min后，再加入70 mL 1 mol/L DTT終止烷基化反應(yīng)。將烷基化后溶液脫鹽至50 mmol/L的碳酸氫銨 (pH 8.0)緩沖液中，以1∶50 (W/W)胰蛋白酶酶解，37 ℃孵育4 h后加入甲酸至終濃度0.1%，終止酶解反應(yīng)，同時酸化肽段。

液相條件：A相為0.1%甲酸，B相為含0.1%甲酸的乙腈，具體液相條件如下表1所示。

質(zhì)譜條件：采集范圍為50?2 000 Da，碰撞能量為20?45 V。

1.3.3 離子交換色譜分析步驟

將樣品稀釋至1 mg/mL，按1% (W/W)比例加入相應(yīng)體積1 mg/mL CpB，室溫孵育20 min。液相條件：A相為 20 mmol/L N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸 (ACES)，pH 6.50 ± 0.05，B相為A相中加入100 mmol/L的NaCl，梯度為0?25 min內(nèi)30%?43%的B相，25?53 min內(nèi)43%?100%的B相。進樣體積為50 μL，流速為0.5 mL/min，柱溫為 40 ℃，于 280 nm波長下進行檢測。

1.3.4 成像毛細管等點聚焦電泳

將 3 μL Pharmalyte 3?10、13 μL Pharmalyte8?10.5、1 μL pI marker 5.85、1 μL pI marker 10.10，70 μL 1%甲基纖維溶液和 102 μL 去離子水溶液混合 (總體積為 190 μL)配制成兩性電解質(zhì)溶液，用水將樣品稀釋至5 mg/mL，加入10 μL至兩性電解質(zhì)溶液中，混勻后加入分析瓶中上機分析。分析參數(shù)為1 500 V 1 min后3 000 V 10 min。

表1 肽圖分析所用的液相條件Table 1 Conditions of UPLC for peptide mapping analysis

1.3.5 毛細管區(qū)帶電泳 (CZE)分析

將樣品用去離子水稀釋至 0.5 mg/mL，加入75 μL至分析瓶中，運行/沖洗緩沖液為40 mmol/L ε-氨基-n-己酸 (EACA)，pH 4.50，0.2%羥丙基甲基纖維素 (HPMC)電泳緩沖液，1.0 psi進樣10 s，20 kV電壓分離15 min，214 nm進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 Edman法及液質(zhì)聯(lián)用法測定N-端氨基酸序列

Edman法表明抗HER2單抗和抗VEGF單抗重鏈的 N 端 15個氨基酸殘基序列均為EVQLVESGGGLVQPG，而輕鏈的N-端15個氨基酸殘基序列均為DIQMTQSPSSLSASV (圖未顯示)。

圖1 抗VEGF單抗重鏈 (A)和輕鏈 (C)以及抗Her2單抗重鏈 (B)和輕鏈 (D)T1肽段的二級質(zhì)譜圖Fig. 1 MS/MS spectrometry of T1 peptide fragments of heavy (Panel A)and light (Panel B)chains of anti-VEGF and anti-Her2 antibody.

胰酶的酶切位點位于賴氨酸或精氨酸后的肽鍵，參照抗Her2單抗和抗VEGF單抗的一級序列，二者酶切后重鏈的T1肽段的氨基酸序列完全相同，均為19個氨基酸，其二級質(zhì)譜圖也可看出其譜圖基本上完全相同 (圖1A和1B)；二者酶切后輕鏈的 T1肽段也完全相同，均為18個氨基酸，且其二級質(zhì)譜可以看出譜圖基本上完全相同 (圖1C和1D)；常規(guī)質(zhì)控方法采用N端測序方法，由于儀器精密度限制，一般要求測定15個氨基酸。IMGT網(wǎng)站 (http://www. imgt.org/)共收錄功能性 IgG胚系基因 59個，若按 N-端15個氨基酸殘基序列則為23類；功能性Igκ胚系基因34個，若按N-端15個氨基酸殘基序列相同分類則為 21類 (表 2)[11]。而所測得的抗HER2單抗和抗VEGF單抗重鏈的重鏈和輕鏈前15個氨基酸分別完全相同，并且均是表1中最高頻的序列。

2.2 肽圖分析

分別比較抗HER2單抗和抗VEGF單抗的重鏈和輕鏈序列，可以發(fā)現(xiàn)其序列相似性均為90%以上，其差異則均來源于CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域。肽圖可通過來源于CDR1、CDR2和CDR3特征性肽段峰可對抗體做出有效鑒別，如圖 2所示 (其中的 L代表輕鏈，H代表重鏈)，美國藥典 (USP)[12]各論中已對抗CD20和Her2單抗鑒別肽段已作出明確要求。

表2 IgG和Igκ胚系基因前15個氨基酸殘基序列統(tǒng)計Table 2 Statistics of N terminal 15 aminoacid sequences deduced from germline IgG and Igκ genes

圖2 抗VEGF單抗和抗Her2單抗鏡像對比的質(zhì)量肽圖Fig. 2 Mirroring comparison of peptide mass mapping between anti-VEGF and anti-Her2 antibody.

2.3 異質(zhì)性分析

抗體的異質(zhì)性可影響單抗的抗原結(jié)合能力、效應(yīng)子功能的發(fā)揮和免疫原性，是單抗批間一致性的重要指標、生物類似物可比較研究的重要環(huán)節(jié)[13-14]，并且作為單抗的內(nèi)在屬性，可作為單抗鑒別的重要分析因素。其中電荷異質(zhì)性的分析一般包括離子交換色譜、毛細管區(qū)帶電泳分析和等電點分析[15]，我們對抗 HER2單抗和抗 VEGF單抗分別用上述3種方法進行了對比分析，結(jié)果如圖3、4、5所示，可以看出兩種單抗均顯現(xiàn)出明顯的差異，結(jié)果證明3種方法均可作為其異質(zhì)性分析和鑒別的重要手段。

圖3 抗VEGF單抗和抗Her2單抗的離子色譜圖Fig. 3 Ion exchange chromatography of anti-VEGF and anti-Her2 antibody.

圖4 抗VEGF單抗和抗Her2單抗的毛細管區(qū)帶電泳圖Fig. 4 Capillary zone electrophoresis of anti-VEGF and anti-Her2 antibody.

圖5 抗VEGF單抗和抗Her2單抗的成像毛細管等點聚焦電泳圖Fig. 5 Imaged Capillary Isoelectric Focusing of anti-VEGF and anti-Her2 antibody.

3 討論

單抗的人源化技術(shù)分為兩大類：第一類為推理法 (Rational approach)[16]，包括CDR移植(CDR grafting)、表面重塑 (Resurfacing)、超人源化 (Superhumanization)以及 HSC (Human String Content)等技術(shù)；第二類為經(jīng)驗法(Empirical method)[17]，包括骨架庫 (FR libraries)、骨架重排 (F R s h u ff l i n g)以及人性化(Humaneering)等技術(shù)。上述技術(shù)的起始步驟必須先從免疫后的鼠兔等動物得到異源單抗，然后再和人源抗體序列作比對，選擇同源性較高的人源序列的骨架區(qū)替代異源單抗相應(yīng)的骨架區(qū)。而作為比對的人源序列大多選擇自胚系基因 (Germline genes)[18]，由于胚系基因的數(shù)量有限，所以不同單抗 CDR1前的第一骨架區(qū)很可能會發(fā)生序列完全相同的情況。人源抗體骨架的選擇有時會來自一致序列 (Consensus sequences)和成熟序列 (Mature sequences)[19]，但是前者為非自然來源序列，后者經(jīng)過不可預(yù)知的經(jīng)過突變的序列，二者都可能會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在實際研發(fā)過程中應(yīng)用較少。而對于全人源單抗，其相應(yīng)的研發(fā)技術(shù)包括導(dǎo)向選擇(Guided selection)[20]、人源化小鼠[21]等，所以應(yīng)用這些技術(shù)多得到的不同單抗第一骨架區(qū)序列也可能完全相同。

人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議(ICH)中Q6B章節(jié)建議，可以選擇N端測序方法對生物技術(shù)類產(chǎn)品進行鑒別實驗，而《中華人民共和國藥典》(2010版)[5]雖然沒有收錄單抗品種，但其中對生物治療性產(chǎn)品基本都要求 N端測序?qū)ζ溥M行鑒別。但是如上所述，不同抗體其第一骨架區(qū)可能相同，而由于Edman技術(shù)所限，一般要求測得N端15個氨基酸，而15個氨基酸完全相同具有非常大的概率 (表 1)，所以N端測序法很多情況下并不能對兩個不同的單抗進行鑒別。同時我們的研究也表明，應(yīng)用標示有特征肽段的肽圖方法以及不同異質(zhì)性分析方法 (包括離子色譜、毛細管區(qū)帶電泳和成像毛細管等點聚焦電泳)則都可以對上述兩種單抗進行有效鑒別。

本研究說明Edman測序法不能對抗VEGF單抗和抗Her2單抗進行有效鑒別，提示在單抗類產(chǎn)品的常規(guī)放行和鑒別實驗中是否應(yīng)囊括N端測序值得進一步商榷，應(yīng)利用肽圖法及多種異質(zhì)性分析方法等對其進行綜合分析鑒別。

[1]Leavy O. Therapeutic antibodies: past, present and future. Nat Rev Immunol, 2010, 10(5): 297.

[2]Buss NA, Henderson SJ, McFarlane M, et al.Monoclonal antibody therapeutics: history and future.Curr Opin Pharmacol, 2012, 12(5): 615–622.

[3]Scolnik PA. mAbs: a business perspective. MAbs,2009, 1(2): 179–184.

[4]Sliwkowski MX, Mellman I. Antibody therapeutics in cancer. Science, 2013, 341(6151): 1192–1198.

[5]Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Beijing: China Medical Science Press, 2010 (in Chinese).國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010

[6]ICH Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products [EB/OL]. [2014-02-09].http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/IC H_Products/Guidelines/Quality/Q6B/Step4/Q6B_Guideline.pdf.

[7]Nelson AL, Dhimolea E, Reichert JM. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics.Nat Rev Drug Discov, 2010, 9(10): 767–774.

[8]Espinosa-de la Garza CE, Perdomo-Abúndez FC,Padilla-Calderón J, et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis, 2013, 34(8):1133–1140.

[9]Anderson CL, Wang Y, Rustandi RR. Applications of imaged capillary isoelectric focussing technique in development of biopharmaceutical glycoprotein-based products. Electrophoresis,2012, 33(11): 1538–1544.

[10]Guo W, Zhang J, Zhang F, et al. Sequencing of amino acids at N-terminus of recombinant antibody. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(6):1059–1063 (in Chinese).郭瑋, 張晶, 張峰, 等. 基因工程單克隆抗體N-端氨基酸序列的測定. 藥物分析雜志, 2012,32(6): 1059–1063.

[11]Zhiqiang An. Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic. John Wiley & Sons, Inc.Sep, 2009.

[12]The United States Pharmacopeial Convention. US Pharmacopoeia. US: The United States Pharmacopeial Convention, 2013.

[13]Liu H, Gaza-Bulseco G, Faldu D, et al.Heterogeneity of monoclonal antibodies. J Pharm Sci, 2008, 97(7): 2426–2447.

[14]Khawli LA, Goswami S, Hutchinson R, et al.Charge variants in IgG1: isolation, characterization,in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats. MAbs, 2010, 2(6): 613–624.

[15]Vlasak J, Ionescu R. Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by charge-sensitive methods.Curr Pharm Biotechnol, 2008, 9(6): 468–481.

[16]Marshall SA, Lazar GA, Chirino AJ, et al. Rational design and engineering of therapeutic proteins.Drug Discov Today, 2003, 8(5): 212–221.

[17]Almagro JC, Fransson J. Humanization of antibodies. Front Biosci, 2008, 13: 1619–1633.

[18]Pelat T, Hust M, Thullier P. Obtention and engineering of non-human primate (NHP)antibodies for therapeutics. Mini Rev Med Chem,2009, 9(14): 1633–1638.

[19]Haidar JN, Yuan QA, Zeng L, et al. A universal combinatorial design of antibody framework to graft distinct CDR sequences: a bioinformatics approach. Proteins, 2012, 80(3): 896–912.

[20]Kim SJ, Hong HJ. Humanization by guided selections. Methods Mol Biol, 2012, 907: 247–257.

[21]Laffleur B, Pascal V, Sirac C, et al. Production of human or humanized antibodies in mice. Methods Mol Biol, 2012, 901: 149–159.