過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3對(duì)腸癌細(xì)胞Lovo增殖活性的影響

章杰兵，徐燕茹，邱 彥，霍中華

·論著·

過(guò)表達(dá)LncRNA-MEG3對(duì)腸癌細(xì)胞Lovo增殖活性的影響

章杰兵，徐燕茹，邱 彥，霍中華

目的 用PCR擴(kuò)增長(zhǎng)鏈非編碼RNA-MEG3，構(gòu)建MEG3真核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腸癌細(xì)胞Lovo，觀察MEG3含量改變對(duì)Lovo細(xì)胞增殖活性的影響。方法 用293細(xì)胞提取人總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，PCR擴(kuò)增MEG3基因并構(gòu)建克隆，陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至Lovo細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h通過(guò)熒光標(biāo)記物GFP觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。RealTime-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)MEG3含量變化。CCK-8檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期基因干預(yù)對(duì)于增殖活性的影響。結(jié)果 成功獲取了MEG3基因并構(gòu)建了重組表達(dá)載體;成功轉(zhuǎn)染Lovo細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為60%;轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)MEG3含量明顯升高，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，相對(duì)含量上升約6.8倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);外源MEG3的高表達(dá)可抑制Lovo細(xì)胞增殖活性，基因干預(yù)后48、72 h，與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 LncRNA-MEG3可顯著抑制Lovo細(xì)胞增殖活性。

LncRNA;Lovo;MEG3;細(xì)胞活性

腸癌是目前世界范圍內(nèi)消化系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性 腫瘤，發(fā)病率僅次于胃和食管癌，是大腸癌的最常見(jiàn)部分，全世界每年因病致死率約為40萬(wàn)［1］。雖然我國(guó)的發(fā)病率原本不高，但近年來(lái)隨著國(guó)民飲食和生活習(xí)慣的改變，其發(fā)病率逐漸上升，并且以平均每年4.2%的速率遞增［2］。因此，探索腸癌新的發(fā)病機(jī)理，尋找新的治療途徑，已成為提高全民健康的迫切要求。

長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)一般是指內(nèi)源性，長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基的RNA序列，母系表達(dá)基因 3(materally expressed gene 3，MEG3)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的 lncRNA［3］。MEG3作為腫瘤抑制因子，在腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及血液瘤中已經(jīng)得到證實(shí)［4］，而其在腸癌細(xì)胞中的作用未有見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人腸上皮細(xì)胞FHC、腸癌細(xì)胞株Lovo購(gòu)于上海中科院細(xì)胞所;胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑及Trizol均為Invitrogen公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)耗材為BD公司產(chǎn)品;pCDF1-copGFP vector購(gòu)于美國(guó)System Biosciences公司;限制性內(nèi)切酶XbaI和EcoR I、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、連接酶、DNA回收試劑盒、熒光定量試劑盒等購(gòu)于大連寶生物工程有限公司;定量檢測(cè)PCR管及無(wú)菌離心管為Axygen公司產(chǎn)品;CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué);質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品，移液器、離心機(jī)為Eppendof公司產(chǎn)品;定量PCR、梯度PCR儀均為Takara公司產(chǎn)品，電泳儀為上海天能公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀及紫外分光光度計(jì)為Thermo公司產(chǎn)品;引物合成及測(cè)序在上海Invitrogen公司完成。

1.2 方法

MEG3重組表達(dá)載體構(gòu)建Lovo細(xì)胞轉(zhuǎn)染、MEG3含量測(cè)定、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性方法參考文獻(xiàn)［3］。

根據(jù)MEG3(NR_002766.2)的RNA序列信息，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，上下游引物分別添加酶切位點(diǎn)Xba I及EcoRΙ及保護(hù)堿基，上游引物添加kozak序列。PCR引物序列:Forward primer-MEG3:5＇-TCTAGA(Xba I)GCCACC(kozak)AGCCCCTAGCGCAGA-3＇;Revese primer-MEG3:5＇-GAATTC(EcoR I)TTGTTAAGACAGGAAACAC-3＇，PCR長(zhǎng)度為1 592 bp。Real Time-PCR檢測(cè)，引物序列:Beta actin-forward primer，5＇-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3＇，Beta actin-reverse primer 5＇-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3＇，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為211bp;MEG3-forward primer 5＇-TGCGGATGGAAGCTGCGGAAGAG-3＇，MEG3-reverse primer 5＇-CGCCCAAACCAGGAAGGAGACGAG-3＇，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為102 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用析因分析進(jìn)行組間差異及組內(nèi)差異的比較。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因獲得

通過(guò)PCR的方法成功得到目的基因，根據(jù)DNA Marker判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與理論值(1 592 bp)完全相符合，PCR反應(yīng)體系無(wú)條帶，說(shuō)明體系未受到污染。見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 克隆構(gòu)建

成功構(gòu)建了MEG3基因真核表達(dá)載體，陽(yáng)性菌落檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，其中2、4號(hào)克隆有目的基因插入，且大小與理論值相符，選取4號(hào)克隆提取質(zhì)粒，用載體多克隆位點(diǎn)上游的通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，完全一致。

圖2 PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌落瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 Lovo細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后48 h，使用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，通過(guò)熒光標(biāo)記物GFP的表達(dá)判斷，細(xì)胞基因?qū)胄始s為90%。見(jiàn)圖3。

圖3 Lovo細(xì)胞轉(zhuǎn)染HE染色圖

2.4 轉(zhuǎn)染后Lovo細(xì)胞內(nèi)MEG3相對(duì)含量分析

以Ct值分析MEG3的相對(duì)含量，以Beta actin作為參照基因。數(shù)據(jù)分析顯示，Lovo細(xì)胞轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MEG3相對(duì)含量明顯上升，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)MEG3相對(duì)含量無(wú)明顯影響(P＞0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 RNA含量檢測(cè)

2.5 MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)Lovo細(xì)胞增殖活性影響檢測(cè)

使用pcDNA-MEG3及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Lovo細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)24、48及72 h，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)數(shù)增殖期，MEG3含量升高能夠明顯抑制Lovo細(xì)胞增殖活性，轉(zhuǎn)染后48、72 h，與對(duì)照組細(xì)胞相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組細(xì)胞活性與未轉(zhuǎn)染組(Lovo組)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，這說(shuō)明轉(zhuǎn)染試劑及實(shí)驗(yàn)本身對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖5。

圖5 細(xì)胞活性檢測(cè)

3 討論

進(jìn)一步研究和揭示結(jié)腸癌的分子發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療途徑和基因治療靶點(diǎn)，一直以來(lái)都是腸癌相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，對(duì)于我國(guó)這樣的人口大國(guó)，直接關(guān)系到全民健康水平。LncRNA起初被認(rèn)為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，因此其不具有生物學(xué)功能。然而，近年研究表明，LncRNA具有諸多生物學(xué)功能:其參與染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)過(guò)程［5-7］;以多種形式影響蛋白功能;影響 miRNA含量。LncRNA的作用方式如下:(1)影響基因啟動(dòng)子區(qū)域，從而干擾鄰近蛋白編碼基因的表達(dá);(2)抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，而影響基因表達(dá);(3)與基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄效率及剪切形式;(4)結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性;(5)作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體;(6)結(jié)合在特定蛋白上從而改變?cè)摰鞍椎陌|(zhì)定位;(7)可作為miRNA的前體分子［8］。

現(xiàn)有研究證實(shí)，腫瘤的形成及發(fā)展，與lncRNA異常密切相關(guān)。第二軍醫(yī)大學(xué)孫樹漢教授課題組，首次發(fā)現(xiàn)了能抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新 LncRNA-Dreh。Gabory A等［9］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。LinR等［10］在2007年發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中LncRNA-MALAT1具有異常表達(dá)，其與腫瘤具有相關(guān)性。lncRNA還被證實(shí)與肝癌的耐藥性有關(guān)，位于染色體19p13.1，CUDR lncRNA可通過(guò)抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表達(dá)而引起細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，當(dāng)其表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞對(duì)化療藥物變得不敏感，產(chǎn)生耐藥［11］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建MEG3重組表達(dá)載體，脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人腸癌細(xì)胞株Lovo，MEG3相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法可以在Lovo細(xì)胞中高效表達(dá)外源性MEG3。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果則說(shuō)明，外源性MEG3的高表達(dá)可明顯抑制Lovo細(xì)胞增殖活性，MEG3含量水平與腫瘤細(xì)胞增殖活性具有負(fù)相關(guān)性，提示MEG3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，其可成為腸癌治療潛在的基因靶點(diǎn)，為腸癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)。

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Effect of LncRNA-MEG3 over-expression on the proliferation activity of colorectal cancer Lovo cells

ZHANG Jie-bing，XU Yan-ru，QIU Yan，HUO Zhong-hua

(Drug and Instrument Control Institute，Joint Logistic Command，Nanjing Military District，Nanjing 210002，China)

Objective To investigate the effect of the changes in MEG3 level on proliferation activity in Lovo cells，through the amplification of the non-coding RNA-MEG3 by PCR and the construction of a eukaryotic expression vector forMEG3，which was transfected into a human colon cancer cell line，Lovo.Methods cDNA was prepared from the total RNA extracted from 293 cells by reverse transcription and MEG3 genewas amplified by PCR and was used to construct a recombinant plasmid，which was transfected into Lovo cells by using cationic liposome.Transfection efficiency was evaluated by observation on the expression of GFPmarker48 hours after transfection，and changes in MEG3 contentwere detected by RT-PCR(Real-time-PCR).CCK-8 was used tomeasure the effect of genetic intervention on proliferative activity in tumor cells in the logarithmic growth phase.Results MEG3 gene was successfully obtained and the recombinant expression vectorwas constructed.Lovo cellswere successfully transfected，and 48 hours after transfection，the transfection efficiency reached as high as60%.MEG3 level in transfected cellswas significantly increased for approximately 6.8 folds，as compared with that of the transfected control group(P＜0.01).High expression ofexogenousMEG3 in Lovo cells could inhibit cell proliferation，and significant differences could be noted at hours 48 and 72 after the genetic intervention，as compared with those of the untransfected group and the transfected control group(P＜0.01).Conclusion LncRNA-MEG3 could obviously inhibit the proliferation of Lovo cells.

LncRNA;Lovo;MEG3;Proliferation activity

R735.3

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.005

210002 南京，南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所(章杰兵);南京軍區(qū)衛(wèi)生部(徐燕茹);解放軍第四五四醫(yī)院(邱彥、霍中華)

霍中華，電子信箱:nky454@126.com