他克莫司對黑素細胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達的影響

李文彬，董 妍，閆小寧，李美紅，劉燕婷，趙一丁

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710003；2.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710004)

他克莫司對黑素細胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達的影響

李文彬1，董 妍2，閆小寧1，李美紅1，劉燕婷1，趙一丁1

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710003；2.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710004)

目的評價他克莫司對人表皮黑素細胞細胞間粘附分子-1(ICAM-1)及基質金屬蛋白酶-2，9(MMP-2、MMP-9)表達的影響。方法實驗分為正常對照組和他克莫司(10、102、103、104nmol/L)處理組，采用Q-RT-PCR和Western blotting方法檢測不同濃度他克莫司對10 ng/m L腫瘤壞死因子-α(TNF-α)預處理后黑素細胞ICAM-1表達的影響，及他克莫司對黑素細胞MMP-2、MMP-9表達的影響。結果與對照組相比，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)可抑制TNF-α誘導的黑素細胞ICAM-1的表達(P＜0.05，P＜0.01)；他克莫司(10、102、103、104nmol/L)可以促進黑素細胞MMP-2、MMP-9的表達(P＜0.05，P＜0.01)。結論他克莫司可能通過抑制ICAM-1表達及促進MMP-2、MMP-9的表達，減少免疫損傷及促進黑素細胞遷移，這可能是其臨床有效治療白癜風的機制之一。

他克莫司；細胞間粘附分子-1；基質金屬蛋白酶；黑素細胞

白癜風是一種由于黑素細胞損傷導致皮膚及毛囊黑色素脫失的獲得性皮膚病。自身免疫異常是白癜風發(fā)病機制之一，其中T淋巴細胞介導黑素細胞損傷在發(fā)病中發(fā)揮著重要作用［1］。因此，阻止黑素細胞與淋巴細胞粘附與促進皮損周圍正常黑素細胞向皮損部位遷移是白癜風治療的關鍵環(huán)節(jié)。細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)與白癜風的疾病進展密切相關，可促進T淋巴細胞與黑素細胞粘附，從而導致黑素細胞的破壞［2］?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類依賴鈣鋅等離子的內肽酶，其活性與細胞的遷移能力密切相關［3］。

他克莫司是一種新型免疫調節(jié)劑，可通過抑制T細胞活化發(fā)揮免疫調節(jié)作用［4］。他克莫司軟膏可有效促進白癜風皮損復色，但機制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司可促進黑素細胞黑素合成和酪氨酸酶活性［5］。在此基礎上本研究將繼續(xù)觀察他克莫司對黑素細胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達的影響，進一步探討他克莫司對黑素細胞的生物學活性的調節(jié)作用，為臨床治療白癜風提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人表皮黑素細胞由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院饋贈；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物科技有限公司；他克莫司、TNF-α、胰蛋白酶溶液購自美國Sigma公司；黑素細胞M254基礎培養(yǎng)基、黑素細胞生長添加物HMG、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購自Ta KaRa公司；鼠抗ICAM-1單克隆抗體購自美國Proteintech公司；鼠抗MMP-2、鼠抗MMP-9單抗購自Santa Cruze公司；兔抗β-actin多克隆抗體、HRP標記羊抗鼠IgG、ECL化學發(fā)光顯色劑購自美國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞的培養(yǎng)和傳代 將培養(yǎng)瓶中的黑素細胞用2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化后，反復吹打成單細胞懸液，離心去上清，加入含50 m L/L的FBS，100 U/m L青霉素和100μg鏈霉素，b FGF的M254培養(yǎng)基的黑素細胞培養(yǎng)液中接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組 將黑素細胞以密度為5×104接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后待細胞生長至80%融合時，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍后加入少量PBS液；他克莫司組：添加含不同濃度他克莫司(10、102、103、104nmol/L)的培養(yǎng)液。對照組：添加黑素細胞培養(yǎng)液；每組設4個復孔。

1.2.3 實時熒光定量PCR(Q-RT-PCR）檢測 采用Trizol法提取細胞總RNA，根據(jù)試劑盒說明提取細胞cDNA。PCR反應引物序列：ICAM-1：5'-GCAGACCACTGTGCTTTGAG-3'，5'-GCAGACCACTGTGCTTTGAG-3'；MMP-2：5'-CACTTTCCTGGGCAACAAAT-3'，5'-TGATGTCATCCTGGGACAGA-3'；MMP-9：5'-TTCAAGGCTGGGAAGTACTG-3'，5'-TCCGGAGGGCCCCGGTCACCT-3'；βactin：5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'；5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'。引物序列由上海生工合成。按照SYBR?Premix Realtime PCR Mix試劑說明使用BioRad iQ5 and MyiQTMReal Time PCR Detection System完成Real time PCR反應；每一樣本同時進行3個PCR反應檢測，用內參βactin對ICAM-1、MMP-2、MMP-9的m RNA表達水平做標準化處理；用Bio Rad iQ5 PCR儀所帶統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理(統(tǒng)計方法為△△Ct法，基因的相對表達按2-△△Ct)，以比較標準化后各組ICAM-1、MMP-2、MMP-9 mRNA的相對表達水平。反應體系采用兩步法在BioRad iQ5 and MyiQTMReal Time PCR Detection System完成Real time PCR反應。反應條件：預變性95℃3 min，PCR反應40個循環(huán)，95℃10 s，55℃30 s。

1.2.4 Western blotting檢測 取20μg蛋白樣品，用120 g/L SDS-PAGE進行電泳，然后在電轉移裝置上，100 V恒壓轉移1 h。將PVDF膜置于含50 g/L脫脂牛奶的TBS-T溶液中4℃封閉過夜；ICAM-1、MMP-2、MMP-9和β-actin一抗分別用TBS-T按1∶2 000和1∶1 000稀釋，膜置于一抗稀釋液中室溫緩慢搖動1 h，二抗辣根過氧化物酶標記的IgG多克隆抗體用TBS-T按1∶200稀釋，膜在二抗稀釋液中室溫慢搖1 h。暗室內ECL發(fā)光檢測。每個實驗組設有4個復孔，每個樣本重復檢測3次。

1.3 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 13.0軟件進行分析。對正態(tài)分布且方差齊的資料采取單因素方差分析檢驗，若統(tǒng)計量F值有統(tǒng)計學意義時，各組間均數(shù)兩兩比較采取LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 他克莫司對黑素細胞ICAM-1 mRNA表達的影響為了觀察他克莫司對TNF-α誘導黑素細胞ICAM-1表達的作用，本研究根據(jù)文獻［6］選用10 ng/mL TNF-α預處理實驗各組黑素細胞誘導其ICAM-1呈過表達，孵育72 h后采用Q-RT-PCR檢測。結果顯示，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同濃度組與對照組相比，黑素細胞ICAM-1 mRNA的相對表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或＜0.01，表1)。

2.2 他克莫司對黑素細胞ICAM-1蛋白表達的影響采用濃度為10 ng/m L TNF-α作用于實驗各組黑素細胞，孵育72 h后采用Western blotting檢測。實驗各組條帶與內參β-actin蛋白條帶吸光度校正分析后表明，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)各組與對照組相比，黑素細胞ICAM-1蛋白的表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或＜0.01，圖1)。

表1 不同濃度他克莫司對黑素細胞ICAM-1 mRNA表達的影響Tab.1 Effects of different concentration of tacrolimus on the expression of ICAM-1 mRNA in melanocytes(2-△△Ct)

圖1 Western blotting檢測各組細胞ICAM-1蛋白的表達Fig.1 Detection of ICAM-1 protein expression using Western blotting

2.3 他克莫司對黑素細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響實驗各組細胞孵育72 h后行Q-RTPCR檢測，結果表明，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同濃度組黑素細胞MMP-2、MMP-9 m RNA的相對表達量與對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或＜0.01，表2)。

表2 他克莫司對黑素細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響Tab.2 Effects of different concentration of tacrolimus on the expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in melanocytes (2-△△Ct)()

表2 他克莫司對黑素細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響Tab.2 Effects of different concentration of tacrolimus on the expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in melanocytes (2-△△Ct)()

與對照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別n MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA 104nmol/L他克莫司4 2.88±0.12**4.73±1.06**103nmol/L他克莫司4 2.29±0.05**4.29±1.21**102nmol/L他克莫司4 1.95±0.06*3.15±0.63**10 nmol/L他克莫司4 1.41±0.05*2.54±0.13*對照組4 0.23±0.03 1.03±0.07

2.4 他克莫司對黑素細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響實驗各組細胞孵育72 h后Western blotting檢測結果顯示，實驗各組條帶與內參β-actin蛋白條帶吸光度校正分析后表明，他克莫司10 nmol/L組細胞MMP-2蛋白的表達和對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)；他克莫司(102、103、104nmol/L)不同濃度組與對照組相比，黑素細胞MMP-2蛋白的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或＜0.01，圖2)；他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同濃度組與對照組相比，黑素細胞MMP-9蛋白的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或＜0.01，圖2)。

圖2 Western blotting檢測各組細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達Fig.2 Detection of MMP-2 and MMP-9 protein expressions using Western blotting

3 討 論

白癜風的發(fā)病機制仍不明確，其發(fā)病可能與機體的細胞免疫和體液免疫密切相關［7-8］。細胞間粘附分子-1(ICAM-1)現(xiàn)統(tǒng)一命名為CD54，是一種重要的免疫球蛋白樣的粘附分子，具有多種生物學功能，參與許多自身免疫性疾病的發(fā)生。研究表明，ICAM-1介導的細胞毒作用是白癜風患者黑素細胞破壞的重要途徑之一，其過程包括通過成對的黏附分子作用與效應淋巴細胞結合，靶抗原與其他細胞表面標志共同活化白細胞表面受體及觸發(fā)細胞毒性作用等［9］。同時發(fā)現(xiàn)白癜風皮損及血清中ICAM-1的水平對白癜風的發(fā)病過程及判斷疾病的活動性具有一定的指導意義［10］。ICAM-1在正常黑素細胞中表達水平較低，但在某些致炎因子誘導下(如TNF-α、白介素-1、脂多糖、干擾素-γ)黑素細胞ICAM-1可呈高表達，并與其在T細胞表面的配體LFA-1相結合從而促進T細胞活化與粘附。TNF-α是一種重要的前炎癥性細胞因子，與許多炎癥性疾病、自身免疫疾病及腫瘤發(fā)展密切相關，可能在白癜風的發(fā)病機制中發(fā)揮著一定作用。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以抑制黑素細胞的增殖和黑素合成，同時TNF-α在白癜風患者的血清中及皮損中的表達均呈過表達，并與ICAM-1表達相一致［11］。

他克莫司作為一種免疫抑制劑，其治療白癜風機制可能是通過阻斷鈣調磷酸酶抑制T淋巴細胞的活化及細胞因子的產生，減少局部黑素細胞受損。為了探求他克莫司免疫抑制作用是否與ICAM-1相關，本研究在體外模仿白癜風體內病理環(huán)境，選用10 ng/mL的TNF-α作用于黑素細胞，誘導其ICAM-1表達，然后觀察他克莫司對黑素細胞ICAM-1表達的影響。結果表明，他克莫司從ICAM-1基因mRNA及蛋白的表達水平上均可抑制TNF-α誘導的黑素細胞ICAM-1的表達，提示他克莫司可能通過抑制ICAM-1表達，從而減弱淋巴細胞對黑素細胞的毒性作用。

白癜風皮損處黑素細胞消失，其復色須經過毛囊黑素細胞儲庫中前體黑素細胞活化、增殖及向皮損處遷移。其中黑素細胞遷移經過與胞外基質粘附、增殖、基質降解、遷移的過程。MMP是一類鋅、鈣離子指依賴性內肽酶，其活性成分可降解許多細胞外基質成分，如膠原、明膠、纖維蛋白，從而促進細胞遷移，其中MMP-2、MMP-9的主要作用是降解基底膜Ⅳ型膠原和纖維粘蛋白和層粘連蛋白。研究表明，MMP-2、MMP-9可降解Ⅳ型膠原蛋白并與惡性黑素瘤細胞的生長、侵襲和轉移等生物學特性密切相關［12］。目前關于MMP與白癜風黑素細胞的遷移功能的研究較少。LAN等［13-14］認為，他克莫司可能通過間接誘導角質形成細胞分泌MMP的活性增加從而形成有利于黑素細胞遷移的環(huán)境；或者通過誘導黑素母細胞向黑素細胞分化促進白癜風復色。近來，LEE等［15］采用明膠酶譜法發(fā)現(xiàn)他克莫司直接通過增加MMP-2、MMP-9的活性促進黑素細胞的遷移。本研究采用Q-RT-PCR及Western blotting方法進一步證實他克莫司可能從mRNA及蛋白的表達水平上誘導黑素細胞MMP-2、MMP-9的表達，提示他克莫司可能通過促進白癜風黑素細胞儲庫中前體黑素細胞向皮損區(qū)遷移從而使白癜風皮膚復色。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)他可莫司可以抑制炎癥因子TNF-α誘導的黑素細胞ICAM-1表達，同時通過促進MMP-2、MMP-9基因的轉錄與蛋白表達。因此，我們推測他克莫司可能通過抑制ICAM-1介導的黑素細胞免疫損傷及增強黑素細胞的遷移能力來治療白癜風，但其具體作用機制仍需進一步研究。

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(編輯 卓選鵬)

The effects of tacrolimus on ICAM-1，MMP-2 and MMP-9 expressions in human melanocytes

LI Wen-bin1，DONG Yan2，YAN Xiao-ning1，LI Mei-hong1，LIU Yan-ting1，ZHAO Yi-ding1
(1.Department of Dermatology，Shaanxi TCM Hospital，Xi'an 710003；2.the Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China)

ObjectiveTo evaluate the effects of tacrolimus on intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)，MMP-2 and MMP-9 expressions in human melanocytes.MethodsIn the experiment melanocytes were divide into normal control group and tacrolimus groups(10，102，103and 104nmol/L).Q-RT-PCR and Western blotting were performed to evaluate the effects of tacrolimus on ICAM-1 expression induced by TNF-α(10 ng/m L)and on MMP-2 and MMP-9 expressions in melanocytes.ResultsCompared with that in control group，the expression of ICAM-1 was suppressed markedly in all the tacrolimus groups(P＜0.05，P＜0.01).However，the expressions of MMP-2 and MMP-9 were increased in all the tacrolimus groups(P＜0.05，P＜0.01).ConclusionTopical tacrolimus can be used as an effective agent to treat vitiligo，maybe due to its inhibiting ICAM-1 expression and inducing MMP-2 and MMP-9 expressions，which can reduce immunologic injury and facilitate migration of menalocytes.

tacrolimus；intercellular adhesion molecule-1；matrix metalloproteinase；melanocyte

R751

A

1671-8259(2014)05-0682-04

10.7652/jdyxb201405023

2014-01-02

2014-04-13

陜西省自然科學基金項目(No.2013JM4043) Supported by the Natural Science Foundation of Shaanxi Province(No.2013JM4043)

李文彬(1973-)，男(漢族)，博士，主治醫(yī)師.研究方向：白癜風、銀屑病發(fā)病機制的研究.E-mail：boerge@sina.com

時間：2014-07-22 16∶33 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1633.012.html