神經(jīng)內(nèi)分泌分化與前列腺癌進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系

侯惠蓮，張冠軍，王鴻雁，宮惠琳，楊 喆，張學(xué)斌

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，陜西西安 710061)

神經(jīng)內(nèi)分泌分化與前列腺癌進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系

侯惠蓮，張冠軍，王鴻雁，宮惠琳，楊 喆，張學(xué)斌

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，陜西西安 710061)

目的研究神經(jīng)內(nèi)分泌分化(neuroendocrine differentiation，NED)與前列腺癌(prostate cancer，PCa)發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。方法收集有隨訪資料的61例PCa穿刺活檢標(biāo)本，采用免疫組化法檢測嗜鉻素A(chromogranin，Cg A)、神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、突觸素(synaptophysin，Syn)在選定標(biāo)本中的表達(dá)，分析NED與PCa各臨床病理參數(shù)及患者生存時(shí)間的關(guān)系，多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響PCa患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。結(jié)果61例PCa患者中有24例伴NED(39.3%)，NED表達(dá)水平隨著Gleason評(píng)分增加及穿刺前前列腺特異性抗原(prostatespecific antigen，PSA)水平升高而逐漸升高(P＜0.01)，Syn分別與NSE及Cg A表達(dá)水平呈正相關(guān)性(P＜0.01)。伴NED組PCa患者累積生存率明顯低于不伴NED組(P＜0.01)，多因素Cox回歸分析顯示Gleason評(píng)分、NED是PCa患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.01)。結(jié)論NED與PCa發(fā)展及患者不良預(yù)后密切相關(guān)，是判斷PCa患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

前列腺癌；神經(jīng)內(nèi)分泌分化；嗜鉻素A；神經(jīng)特異性烯醇化酶；突觸素

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著老年男性的健康，大部分患者經(jīng)內(nèi)分泌治療后發(fā)展為預(yù)后不良的激素非依賴性，這與PCa組織中存在神經(jīng)內(nèi)分泌分化(neuroendocrine differentiation，NED)密切相關(guān)，NED在PCa的生物學(xué)行為中起著重要作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)大部分PCa具有不同程度的NED，而且在低分化、晚期腫瘤中明顯增加，但NED可否作為判斷激素敏感性PCa的發(fā)展及預(yù)后的指標(biāo)仍有爭議［2-3］。

局部NED是指經(jīng)典的PCa中存在單個(gè)或小巢樣神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和非神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞在形態(tài)上無明顯差異，可應(yīng)用特異性神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物，如神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、嗜鉻素A(chromogranin，Cg A)和突觸素(synaptophysin，Syn)等進(jìn)行免疫組織化學(xué)表達(dá)區(qū)分［4］。研究表明，在前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織中，NED、Cg A的表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，其表達(dá)水平升高是腫瘤診斷及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)［5］，但這3種特異性NED標(biāo)志物，特別是Syn在PCa伴NED中的表達(dá)率尚有爭論［5-6］，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究采用免疫組織化學(xué)Max Vision法，檢測61例穿刺活檢的PCa組織中NSE、Cg A、Syn表達(dá)，并分析其表達(dá)率與伴局部NED患者各臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以明確NED與PCa發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2005年2月～2008年1月間臨床病理資料完整、未經(jīng)任何治療的61例穿刺活檢前列腺癌的石蠟包埋標(biāo)本，年齡44～83歲，平均(71.52±7.31)歲，中位年齡72歲，其中≥70歲44例，＜70歲17例；活檢前血清前列腺特異性抗原(PSA)水平3～1 100 ng/mL，平均(132.26±210.53)ng/mL，中位值71 ng/m L，其中≥20 ng/mL 47例，＜20 ng/mL 14例。其中檢出24例PCa伴局部NED，年齡54～82歲，平均(71.83±7.41)歲，中位年齡71.5歲；活檢前血清PSA水平3～1 100 ng/m L，平均(135.73±279.33)ng/m L，中位值46.8 ng/mL。另37例PCa(作為對(duì)照組)，年齡44～83歲，平均(71.32±7.34)歲，中位年齡72歲；活檢前血清PSA水平6.3～756.9 ng/mL，平均(130.01±154.94) ng/mL，中位值100 ng/mL。

1.2 臨床病理資料和隨訪情況復(fù)查原HE切片，進(jìn)行Gleason評(píng)分(6分、7分、8～10分)，其中Gleason 6分22例、Gleason 7分21例、Gleason 8～10分 18例，無Gleason 2～5分的病例。臨床分期結(jié)合國際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)推薦使用的TNM標(biāo)準(zhǔn)，分為：T1～T2期13例、T3～T4期48例，因?yàn)槭腔顧z標(biāo)本，因此未作N、M分期。

對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，截至隨訪時(shí)間為2012年12月31日，隨訪時(shí)間為22～90.5月，中位隨訪時(shí)間為66.3月，平均隨訪時(shí)間(61.29±15.42)月。18例死于腫瘤進(jìn)展，無因非腫瘤并發(fā)癥死亡病例。

1.3 免疫組化Max Vision技術(shù)檢測NSE、CgA和Syn表達(dá)免疫組織化學(xué)所用一抗、大鼠抗人單克隆抗體NSE、Cg A和兔抗人單克隆抗體Syn及其試劑盒均為即用型試劑，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

組織均為100 m L/L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，HE染色復(fù)查。切片脫蠟、水洗、抗原修復(fù)、羊血清封閉、滴加即用型一抗(無需稀釋)、PBS洗片、滴加二抗(室溫孵育)、DAB顯色、蘇木精復(fù)染核、中性樹膠封片。TBS代替一抗作空白對(duì)照，用已知肺小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、PCa及其正常組織作陽性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)NSE、Syn、Cg A均以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性。每例計(jì)數(shù)500個(gè)癌細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，將陽性細(xì)胞按其數(shù)量分為3個(gè)等級(jí)，陽性細(xì)胞數(shù)在1～10%為(+)，陽性細(xì)胞數(shù)在11%～50%之間為(?)，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為(?)，顯色強(qiáng)度與背景無明顯差異者為(-)；即(+)為弱陽性，(?)為陽性，(?)為強(qiáng)陽性，(-)為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，各標(biāo)志物免疫組化表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，標(biāo)志物的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用線性χ2檢驗(yàn)(Linear-by-linear association)，患者的生存時(shí)間采用Kaplan-Meier法分析并繪制生存曲線；多因素生存分析采用多因素COX回歸分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCa組織中NSE、CgA、Syn表達(dá)及NED的病理特點(diǎn)NSE、Cg A、Syn均表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中(圖1B、圖1C、圖1D)。61例PCa組織中NSE陽性(+)25例、(?)6例，無強(qiáng)陽性(?)表達(dá)病例，陽性率50.8%；Cg A陽性(+)21例，(?)3例(圖1)，無強(qiáng)陽性(?)表達(dá)病例，陽性率39.3%；Syn陽性(+)4例、(?)1例，無強(qiáng)陽性(?)表達(dá)病例，陽性率8.2%。NSE和Cg A共表達(dá)者合計(jì)為24例(39.3%)，NSE、Cg A和Syn共表達(dá)者5例，并且Syn陽性均出現(xiàn)在NSE與Cg A共表達(dá)的病例中，3種均為陰性共30例。NSE和Cg A陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.622，P= 0.203，P＞0.05)，但NSE與Syn和Cg A與Syn陽性率比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.638，P= 0.001；χ2=16.330，P=0.001)。

為避免誤差可能，采用兩種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物同時(shí)陽性者診斷為PCa伴局部NED。在61例PCa組織中總計(jì)病理診斷有24例PCa伴局部NED(39.3%)。伴NED癌組織的病理特點(diǎn)是：24例神經(jīng)內(nèi)分泌特異性標(biāo)志物陽性表達(dá)的細(xì)胞單個(gè)散在或呈灶狀或片團(tuán)狀分布。細(xì)胞大小形態(tài)與周圍經(jīng)典的PCa細(xì)胞相似，呈立方狀或卵圓形，核膜清楚，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，可見嗜酸性核仁，胞質(zhì)量多少不等，淡伊紅色(圖1A)。

圖1 PCa伴NED的HE染色病理改變（A）及PCa中NSE、CgA和Syn的免疫組化表達(dá)（B、C、D）Fig.1 Morphological patterns in Pca accompanied with NED(A，H&E staining)as well as immunohistochemical detection of NSE，Cg A and Syn(B，C and D)in PCa(×400)

2.2 PCa伴局部NED組織中NSE、CgA及Syn陽性表達(dá)的相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，在PCa伴局部NED組織中，NSE與Cg A、Syn間陽性表達(dá)率呈正相關(guān)性(NSE與Cg A，rs=0.745，P= 0.000；NSE與Syn，rs=0.453，P=0.001；Cg A與Syn，rs=0.428，P=0.002)，即在PCa中隨著NSE表達(dá)率升高，Cg A的表達(dá)率亦隨之升高(P＜0.01)。雖然Syn在PCa中的陽性表達(dá)率低，但與NSE陽性表達(dá)率之間亦存在正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

2.3 NED與PCa患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系在61例PCa中，PCa伴局部NED的陽性率隨著Gleason評(píng)分的增加及穿刺活檢前血清PSA水平的升高而逐漸升高(P＜0.01)，雖然與不同患者年齡分段及臨床分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但有升高趨勢(表1)。

2.4 生存分析61例患者均獲得隨訪資料，最短隨訪時(shí)間為22個(gè)月，截至隨訪結(jié)束時(shí)死亡18例，43例均帶瘤生存，中位生存時(shí)間為66.3個(gè)月，累積生存率為70.5%，其中伴有NED的PCa患者中位生存時(shí)間為55.2個(gè)月，累積生存率為50%。采用Kaplan-Meier法繪制PCa患者的生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示伴有NED與PCa患者穿刺活檢后累積生存率相關(guān)(χ2=12.058，P＜0.01)，即伴有NED的PCa患者生存時(shí)間明顯縮短，預(yù)后更差(圖2)。

表1 PCa組織伴發(fā)或不伴發(fā)NED與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Clinicopathological parameters of PCa patients with NED(+ve)and those without NED(-ve)

圖2 采用Kaplan-Meier法分析61例PCa患者累積生存情況Fig.2 Survival of PCa patients with or without NED analyzed by Kaplan-Meier method

2.5 預(yù)后因素分析將初步篩選出的可能影響預(yù)后的因素(患者的年齡、穿刺活檢前血清PSA水平、腫瘤Gleason評(píng)分、臨床分期、NED)引入多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，似然比χ2=24.266，P＜0.01，最終確定NED及腫瘤Gleason評(píng)分與患者生存預(yù)后有關(guān)［NED：回歸系數(shù)β=1.619，標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)=0.572，Wald值=8.006，P=0.005，相對(duì)危險(xiǎn)度Exp(β)= 5.046；Gleason評(píng)分：回歸系數(shù)β=1.640，標(biāo)準(zhǔn)誤SE =0.474，Wald值=11.960，P=0.001，相對(duì)危險(xiǎn)度Exp(β)=5.155］，回歸系數(shù)＞0，提示NED及腫瘤Gleason評(píng)分是PCa患者死亡的高危因素。

3 討 論

大多數(shù)PCa存在局部NED，PCa組織中大部分神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞是以單個(gè)或灶狀聚集分布，與周圍PCa細(xì)胞形態(tài)無明顯差別，可應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測組織中特異性神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物(NSE、Cg A、SYN等)表達(dá)來區(qū)分［4］。因此，本研究采用免疫組化方法檢測標(biāo)記物NSE、Cg A、SYN在PCa中的表達(dá)，以發(fā)現(xiàn)伴發(fā)的NED的成分，為避免誤差可能，采用兩種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物同時(shí)為陽性者診斷為PCa伴NED。本研究結(jié)果顯示，PCa伴局部NED的陽性率為39.3%，其中NSE陽性表達(dá)率較高(50.8%)，是檢測NED較敏感的指標(biāo)，同樣Cg A亦有較高的陽性表達(dá)率(39.3%)，并且有24例NSE與Cg A共表達(dá)。此外，亦顯示NSE陽性表達(dá)率隨著Cg A表達(dá)增加而升高，兩者呈正相關(guān)性；而Syn陽性表達(dá)率低(8.2%)，并且均出現(xiàn)在NSE與Cg A共表達(dá)的陽性病例中，表明NSE與Cg A聯(lián)合應(yīng)用是判定PCa伴局部NED較可靠的指標(biāo)，支持了ATHER等［6］的觀點(diǎn)。而STEIN等［5］研究認(rèn)為，Syn在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中表達(dá)率高，其敏感性和特異性均較高?？傊?，Syn陽性表達(dá)率仍有爭議，需待進(jìn)一步研究。

近年研究認(rèn)為，NED對(duì)PCa的進(jìn)展及預(yù)后起著重要作用［2］。但越來越多的免疫組織化學(xué)和血清學(xué)研究表明，NED是激素非依賴性PCa的一項(xiàng)重要的預(yù)后指標(biāo)［7］。PCa神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞可能通過自分泌調(diào)節(jié)、旁分泌作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞雄激素非依賴性增殖［2］。NED是否能作為激素依賴性PCa的預(yù)后判斷標(biāo)準(zhǔn)，目前仍有爭議。JEETLE等［3］研究發(fā)現(xiàn)，與無NED的PCa比較，有NED的PCa患者預(yù)后更差，可作為一個(gè)獨(dú)立的判斷預(yù)后的指標(biāo)。在本組單因素分析中，具有NED的PCa患者生存時(shí)間明顯縮短，多因素回歸分析證實(shí)局部NED與腫瘤Gleason評(píng)分同樣重要，是影響PCa患者生存的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，是判斷PCa患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本組結(jié)果還顯示，PCa伴NED的陽性率隨著Gleason評(píng)分的增高及穿刺前血清PSA水平的增加而逐漸升高，雖然與患者不同年齡及臨床分期的進(jìn)展無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但還是有升高趨勢，與FRANCO等［2］的觀點(diǎn)一致，進(jìn)一步證實(shí)NED與PCa的進(jìn)展及患者的不良預(yù)后有關(guān)。

總之，NED與PCa的發(fā)展及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，是判斷PCa患者預(yù)后的獨(dú)立因素。因此，在進(jìn)行PCa穿刺標(biāo)本形態(tài)學(xué)觀察時(shí)，若有NED成分存在，應(yīng)在病理報(bào)告中加以說明。

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(編輯 國 榮)

Neuroendocrine differentiation in prostate cancer and its correlation with tumor progression and prognosis

HOU Hui-lian，ZHANG Guan-jun，WANG Hong-yan，GONG Hui-lin，YANG Zhe，ZHANG Xue-bin
(Department of Pathology，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the relationship of neuroendocrine differentiation(NED)with the progression and prognosis of prostate cancer(PCa).MethodsWe collected 61 prostate specimens on needle biopsy to identify the expressions of NED markers including chromogranin(Cg A)，neuron-specific enolase(NSE) and synaptophysin(Syn)by immunohistochemistry.The relationship of NED with clinicopathological and survival data and risk factors affecting PCa patients'prognosis were analyzed using multivariable Cox regression analysis.ResultsNED was detected in 24 out of 61 patients(39.3%).High NED rate was significantly associated with a high level of prostate-specific antigen(PSA)，high Gleason score and shortened survival time in patients with PCa (P＜0.01).Syn positively correlated with NSE and Cg A expression level，respectively(P＜0.01).Cumulative survival rate was significantly lower in PCa patients with NED than in those without.Multivariable Cox regression analysis showed NED and Gleason scores were independent factors affecting the survival of PCa patients(P＜0.01).ConclusionThe Results suggest that NED is closely associated with poor prognosis and progression of PCa；therefore，NED is an independent factor for evaluating the prognosis of PCa.

prostate cancer(PCa)；neuroendocrine differentiation(NED)；prognosis；chromogranin(Cg A)；neuron-specific enolase(NSE)；synaptophysin(Syn)

R973.25

A

1671-8259(2014)05-0674-04

10.7652/jdyxb201405021

2014-01-13

2014-04-12

陜西省科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(No.2012K13-02-04) Supported by the Science and Technology Research Project of Shaanxi Province(No.2012K13-02-04)

侯惠蓮(1964-)，女(漢族)，博士，副教授.研究方向：前列腺腫瘤病理.E-mail：hhlsnl@sina.com

時(shí)間：2014-07-22 16∶24 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1624.008.html