洛汀新和科素亞對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用

肖夢(mèng)云，王小丹，洪 權(quán)，趙德龍，喻 陸

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東廣州 510515；2.解放軍第301醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100039；3.解放軍第305醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100017)

洛汀新和科素亞對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用

肖夢(mèng)云1，王小丹2，洪 權(quán)2，趙德龍2，喻 陸3

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東廣州 510515；2.解放軍第301醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100039；3.解放軍第305醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100017)

目的觀察血管緊張素(AngiotensinⅡ，AngⅡ)對(duì)糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠足細(xì)胞損傷的作用及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEIs)洛汀新和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARBs)科素亞對(duì)損傷足細(xì)胞的保護(hù)作用。方法60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單腎切除組、單腎切除+洛汀新組［10 mg/(kg·d)灌胃］、單腎切除+科素亞組［20 mg/(kg·d)灌胃］、糖尿病腎病組、糖尿病腎病+胰島素注射組(早晚各2U甘精胰島素皮下注射)、糖尿病腎病+胰島素注射+洛汀新組和糖尿病腎病+胰島素注射+科素亞組，共8組。通過(guò)右腎切除+STZ 45 mg/kg一次性腹腔注射建立Ⅰ型DN模型，模型建立16周后進(jìn)行藥物干預(yù)，期間每4周稱量大鼠體質(zhì)量，藥物干預(yù)8周后處死動(dòng)物。留取血清和尿標(biāo)本，觀察血糖、尿糖、尿蛋白/肌酐和AngⅡ的變化；留取腎組織標(biāo)本，稱量腎質(zhì)量，行光鏡檢查，提取腎小球，Western blot檢測(cè)腎小球組織中Nephrin和Podocin的表達(dá)。結(jié)果①與對(duì)照組相比，DN組大鼠血糖、尿糖明顯升高、腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯增加(P＜0.01)；體質(zhì)量明顯減輕(P＜0.01)。與DN組相比，洛汀新和科素亞干預(yù)大鼠體質(zhì)量均明顯增加(P＜0.05)。②DN組大鼠腎臟病理呈DN早期表現(xiàn)(系膜增殖、系膜基質(zhì)增加，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔狹窄，可見(jiàn)蛋白管型)。洛汀新和科素亞干預(yù)組大鼠腎臟病理表現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。③與對(duì)照組相比，科素亞治療大鼠血清中AngⅡ水平明顯增加(P＜0.05)。④DN組與洛汀新治療組Podocin和Nephrin的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論洛汀新和科素亞對(duì)糖尿病腎病都具有一定的足細(xì)胞保護(hù)作用；鑒于科素亞治療組大鼠血清中的AngⅡ水平明顯升高，使得洛汀新在發(fā)揮對(duì)早期糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用方面更具前景。

洛汀新；科素亞；糖尿病腎??；足細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是最常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，已成為我國(guó)終末期腎臟疾病(end stage renal diease，ESRD)的第2大病因［1］。由于早期DN積極治療后臨床癥狀和病理改變均可恢復(fù)正常，因此，治療早期DN對(duì)于防止DN向ESRD轉(zhuǎn)化意義重大。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensinⅡreceptor blockers，ARBs)通過(guò)其非血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)對(duì)DN具有獨(dú)立于降壓之外的腎保護(hù)作用，但確切的機(jī)制目前仍不清楚。足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(系膜細(xì)胞)和腎小球基底膜一起，構(gòu)成腎小球的濾過(guò)屏障。因足細(xì)胞為高度分化細(xì)胞，再生能力有限，故其損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致DN蛋白尿及DN進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。因此，探究導(dǎo)致DN足細(xì)胞損傷的機(jī)制顯得尤為重要。在現(xiàn)有的研究中，已了解到血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可能是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的機(jī)制之一［2］。由此我們推測(cè)ACEI類藥物和ARB類藥物是通過(guò)抑制DN時(shí)足細(xì)胞中升高的AngⅡ水平改善足細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究意在觀察ACEI類及ARB類藥物對(duì)DN模型大鼠足細(xì)胞nephrin、podocin蛋白表達(dá)的影響，探討其在DN治療中發(fā)揮腎保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器12周齡正常雄性Wistar大鼠60只(購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司)，清潔級(jí)，體質(zhì)量(420.37±29.02)g。STZ (Sigma-Aldrich)；拜耳血糖儀及試紙條。血漿血管緊張素Ⅱ放免藥盒(北京原子高科股份有限公司)。鹽酸貝那普利片(洛汀新，北京諾華制藥有限公司)；氯沙坦鉀片(科素亞，杭州默沙東制藥有限公司)。小鼠抗β-actin抗體(Sigma-Aldrich)、兔抗nephrin抗體(Prosci)和兔抗podocin抗體(Protein Tech Group)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2 動(dòng)物分組60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C，n=4)、單腎切除組(NX，n=4)、單腎切除+洛汀新組(NX+B，n=6)、單腎切除+科素亞組(NX+L，n= 6)、糖尿病腎病組(DN，n=10)、糖尿病腎病+胰島素注射組(DN+IR，n=10)、糖尿病腎病+胰島素注射+洛汀新組(DN+IR+B，n=10)和糖尿病腎病+胰島素注射+科素亞組(DN+IR+L，n=10)。

1.3 糖尿病腎病模型的建立糖尿病腎病模型采用一側(cè)腎臟切除術(shù)+鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立［3］。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后行單腎切除術(shù)，手術(shù)均經(jīng)背部入路切除右側(cè)腎臟，大鼠術(shù)后恢復(fù)1周，采用單次腹腔注射STZ 45 mg/kg(臨用前以p H 4.2的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液新鮮配制)。STZ注射72 h后尾靜脈采血并測(cè)定隨機(jī)血糖，7 d后復(fù)測(cè)隨機(jī)血糖，以2次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病造模成功。正常對(duì)照大鼠予以等體積溶劑(檸檬酸緩沖液)腹腔注射。造模后每4周測(cè)量大鼠體質(zhì)量，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)糖尿病大鼠血糖及一般情況。

1.4 藥物干預(yù)糖尿病模型建立后第16周開始藥物干預(yù)。NX+B、DN+B組給予洛汀新10 mg/(kg·d)［4］；NX+L、DN+L組給予氯沙坦20 mg/(kg·d)［5］；對(duì)照組均給予等量生理鹽水；各組大鼠灌胃給藥。IR注射大鼠均給予4 U/d甘精胰島素注射液皮下注射(早晚各2 U)。

1.5 取材和病理觀察藥物干預(yù)8周。處死大鼠前1 d稱量體質(zhì)量、收集尿液、測(cè)量血糖等。予戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射，迅速分離腎臟，取腎皮質(zhì)，40 m L/L甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，氯仿透明，石蠟包埋，切片機(jī)切片，石蠟切片行PAS染色，顯微鏡下觀察腎小球結(jié)構(gòu)。

1.6 放免法檢測(cè)大鼠血中AngⅡ水平腹主動(dòng)脈采血收集于1.5 m L EP管，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存，AngⅡ放射免疫分析藥盒，按說(shuō)明書步驟混勻試劑和樣本，4℃放置15 min，3 500 r/min離心15 min，吸上清液，測(cè)定沉淀數(shù)［c/min，放免儀器(北京原子高科股份有限公司)：r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀］。按說(shuō)明書提供的公式計(jì)算檢測(cè)結(jié)果。

1.7 Western blot檢測(cè)腎小球podocin和nephrin的蛋白表達(dá)提取腎小球［6］：取腎臟組織，4℃生理鹽水沖洗，剝離腎包膜，用剪刀把腎皮質(zhì)剪成碎塊。將研磨組織放入重疊不銹鋼篩網(wǎng)(孔徑為250、106、75μm)。在最上層(250μm)篩網(wǎng)上用消毒針筒內(nèi)蕊輕壓腎皮質(zhì)，同時(shí)用4℃生理鹽水輕輕沖洗，濾入第2層篩網(wǎng)中(106μm)。繼續(xù)用生理鹽水沖洗第2層篩網(wǎng)，同時(shí)輕研組織，濾過(guò)第3層篩網(wǎng)中(75μm)。在第3層濾器上吸出少許組織，鏡下觀察，若只有純凈小球而幾乎不含小管即可停止沖洗，(腎小球純度＞95%)，收集此層組織移入離心管，離心后棄去上清，沉淀凍存于-80℃。由于本實(shí)驗(yàn)中提取的腎小球組織較少，故將各組組內(nèi)大鼠腎小球組織混勻一并提取腎小球總蛋白。

用8 mmol/L UREA Buffer提取腎小球總蛋白并測(cè)定蛋白濃度［7］。取100μg蛋白變性后加入預(yù)制的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干法轉(zhuǎn)入NC膜，1∶100 casin封閉1 h后加入一抗(nephrin、podocin按1∶500稀釋；β-actin按1∶5 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜5 min×3，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(nephrin和podocin)和山羊抗小鼠IgG二抗(β-actin)(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，5 min×3，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以βactin為內(nèi)參照，通過(guò)計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比進(jìn)行半定量分析，每個(gè)蛋白指標(biāo)重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病腎病動(dòng)物模型建立情況成模大鼠出現(xiàn)典型的多飲、多尿、多食、體質(zhì)量減輕等糖尿病癥狀，精神萎靡，毛色暗淡，無(wú)光澤，易脫落。經(jīng)洛汀新和科素亞干預(yù)后，糖尿病大鼠反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤度有所增加，多飲多尿癥狀有所減輕，體質(zhì)量較DN組明顯增加(P＜0.05，表1)，但各治療組間大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組大鼠飲食、飲水、尿量正常，毛發(fā)光亮，體質(zhì)量自然增加。NX組大鼠與C組大鼠外觀及一般情況均無(wú)明顯差異，藥物干預(yù)沒(méi)有明顯影響。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況的比較Tab.1 Changes of body mass of the rats(g，xˉ±s)

與C組相比，NX組、NX+B組、NX+L組、DN組、DN+IR組、DN+IR+B組、DN+IR+L組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)重比值均升高(P均＜0.01)，其中DN組、DN+IR組、DN+IR+B組、DN+IR+L組比NX各組增加更明顯(P＜0.01)，經(jīng)藥物治療后各組腎質(zhì)量/體質(zhì)重比值均下降(P＜0.01)，但各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與C組相比，DN各組大鼠在接受胰島素治療前血糖明顯增加(P＜0.01)，NX各組與C組相比血糖差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，接受胰島素治療各組大鼠血糖控制在10.0～20.0 mmol/L之間，較DN組血糖下降明顯(P＜0.01)；與C組相比，DN各組尿糖明顯升高(P＜0.01)，藥物治療對(duì)DN各組大鼠尿糖的改善差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；NX各組尿糖較C組無(wú)明顯差異。DN各組尿蛋白/肌酐與C組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

表2 各組大鼠血糖、尿糖、腎質(zhì)量/體質(zhì)量及尿蛋白/肌酐值Tab.2 Blood glucose，urine glucose，kidney mass/body mass ratio，and urine protein/creatinine value of the rats()

表2 各組大鼠血糖、尿糖、腎質(zhì)量/體質(zhì)量及尿蛋白/肌酐值Tab.2 Blood glucose，urine glucose，kidney mass/body mass ratio，and urine protein/creatinine value of the rats()

與C組相比，**P＜0.01。C：正常對(duì)照組；NX：?jiǎn)文I切除組；NX+B：?jiǎn)文I切除+洛汀新組；NX+L：?jiǎn)文I切除+科素亞組；DN：糖尿病腎病組；DN +IR：糖尿病腎病+胰島素注射組；DN+IR+B：糖尿病腎病+胰島素注射+洛汀新組；DN+IR+L：糖尿病腎病+胰島素注射+科素亞組。

項(xiàng)目C組(n=4) NX組(n=4) NX+B組(n=6) NX+L組(n=6) DN組(n=10) DN+IR組(n=10) DN+IR+B組(n=10) DN+IR+L組(n=10)血糖(mmol/L)7.03±0.46 7.00±1.48 7.17±0.31 7.38±0.71 41.65±5.61**17.25±4.22**17.02±3.31**16.62±2.13**尿糖(mmol/L)0.50±0.20 0.43±0.20 0.72±1.15 0.25±0.26 42.86±2.32**35.88±4.50**39.32±1.19**41.54±2.40**尿蛋白/肌酐0.18±0.12 0.14±0.04 0.18±0.09 0.54±0.36**0.18±0.07 0.29±0.15 0.38±0.22 0.22±0.07腎質(zhì)量/體質(zhì)量0.0026±0.000 3 0.0040±0.0002**0.0042±0.0001**0.0040±0.0002**0.0092±0.0009**0.0064±0.0003**0.0065±0.0006**0.0067±0.0003**

2.2 各組大鼠腎臟的病理表現(xiàn)NX各組大鼠腎小球輕度增大，未見(jiàn)明顯系膜增殖，小管形態(tài)和結(jié)構(gòu)均正常。DN組大鼠腎小球增大，腎小球系膜基質(zhì)明顯增多，系膜細(xì)胞數(shù)目增加，可見(jiàn)糖尿病腎病的典型病理改變——腎小囊脂滴形成［8］(圖1E)，囊腔變窄，部分毛細(xì)血管腔狹窄；可見(jiàn)硬化的腎小球，小管細(xì)胞肥大、腫脹，管腔變窄，可見(jiàn)蛋白管型。DN+IR組DN病理改變未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)。而DN+IR+B及DN+IR +L組大鼠腎小球增大、腎小囊腔變窄和小管管腔變窄等病理?yè)p傷程度減弱(圖1)。

圖1 各組大鼠腎臟病理顯微圖像Fig.1 Microscopic images of renal pathology of the rats(PAS-stained，×400)

2.3 各組大鼠血清中AngⅡ水平的比較NX+L組和DN+IR+L組大鼠血清中AngⅡ水平較C組明顯增加(P＜0.05)，其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.4 各組大鼠腎小球足細(xì)胞足突標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況 利用Western blot方法檢測(cè)8組大鼠腎小球中足細(xì)胞標(biāo)志物podocin及nephrin的表達(dá)水平。nephrin是裂孔隔膜的主要成分［9］，特異性表達(dá)于裂孔隔膜上，為免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持足細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。podocin通過(guò)其C末端與nephrin及CD2AP的胞內(nèi)段相互作用，可促進(jìn)nephrin誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組相比，DN組與DN+IR+B組podocin和nephrin的蛋白表達(dá)量均明顯增加(P＜0.05)；而其余各組較C組podocin和nephrin的蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DN組podocin和nephrin蛋白表達(dá)量與其他組相比，除DN+IR+B組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外均明顯增加(P＜0.05，圖3)。

3 討 論

足細(xì)胞(腎小球臟層上皮細(xì)胞)是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分。足細(xì)胞損傷可導(dǎo)致蛋白尿和腎小球硬化，而這正是DN的主要表現(xiàn)。目前，越來(lái)越多的研究顯示足細(xì)胞損傷是DN發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［10］。足細(xì)胞由胞體、主突和足突3部分組成［11］。足突是足細(xì)胞的標(biāo)志性特征［12］，相鄰足突之間的橋接結(jié)構(gòu)稱之為裂孔隔膜，由nephrin、podocin、P鈣調(diào)素蛋白和相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白如CD2AP等蛋白構(gòu)成，裂孔隔膜及其相關(guān)蛋白和足突組成了防止蛋白尿?yàn)V過(guò)的重要分子屏障［13］，其表達(dá)量的異常(高或低)均對(duì)足細(xì)胞的病理情況有一定的啟示。故本實(shí)驗(yàn)中用nephrin及podocin蛋白作為足細(xì)胞標(biāo)志物以評(píng)估足細(xì)胞損傷情況。

DN足細(xì)胞損傷可能的機(jī)制有：AngⅡ、氧化應(yīng)激、高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥因子等［14］。其中AngⅡ增強(qiáng)可能是糖尿病腎病的病因之一。而AngⅡ?qū)е伦慵?xì)胞損傷的可能機(jī)制為：①DN時(shí)，腎臟組織中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)激活，足細(xì)胞中的AngⅡ濃度升高，而高濃度的AngⅡ則導(dǎo)致足細(xì)胞中氧化蛋白聚積及線粒體損傷［15］；②高水平的AngⅡ通過(guò)增加足細(xì)胞內(nèi)Ca2+活性，引起Rac-依賴的及活性氧族介導(dǎo)的F-actin細(xì)胞骨架重排，而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷［16］；③AngⅡ(協(xié)同TGF-B1)可通過(guò)p38 MAPK和caspase-3途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡［17］。有研究證實(shí)，在高糖環(huán)境下的體外足細(xì)胞和糖尿病動(dòng)物模型中，血管緊張素原和AngⅡⅠ型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)的m RNA和蛋白表達(dá)量顯著增加，而適應(yīng)性的AT1R增多又可進(jìn)一步增強(qiáng)AngⅡ活性［18］。

因此，抑制AngⅡ很大程度上能阻止對(duì)足細(xì)胞有害的進(jìn)程，減少足細(xì)胞損傷范圍。一項(xiàng)大型的人體試驗(yàn)證明抑制AngⅡ可以減輕蛋白尿和慢性腎臟病進(jìn)展［19］。

圖2 各組大鼠血中AngⅡ水平的比較Fig.2 Comparison of serum AngⅡlevel in rats(pg/mL，)

圖3 各組大鼠腎小球組織中podocin和nephrin蛋白表達(dá)變化（A）及半定量分析結(jié)果（B、C）Fig.3 Changes of podocin and nephrin protein expressions in glomeruli tissue of rats(A)and semi-quantitative analysis(B，C)

ACEI和ARBs藥物都可以有效抑制AngⅡ收縮血管、升高血壓、促進(jìn)醛固酮分泌、水鈉潴留、交感神經(jīng)興奮等的生理學(xué)效應(yīng)，但其作用機(jī)制不同。ACEI藥物通過(guò)抑制ACE的活性，使AngⅠ無(wú)法生成AngⅡ，抑制了AngⅡ的經(jīng)典生成途徑，從而使體內(nèi)的AngⅡ水平下降。而ARBs藥物則是通過(guò)選擇性阻斷血管緊張素受體1，與血管平滑肌、腎上腺、腎、心等組織的細(xì)胞膜上的AT1受體相結(jié)合，導(dǎo)致血管阻力降低，醛固酮分泌減少，而血清中AngⅡ水平反而增高。洛汀新和科素亞分別為ACEI類和ARB類的代表藥物，也經(jīng)常被用于治療DN，其能有效改善蛋白尿、具有一定的腎臟保護(hù)作用也已廣為人知。

本實(shí)驗(yàn)利用單腎切除+中低劑量(45 mg/kg) STZ注射成功建立了早期1型糖尿病腎病模型。經(jīng)洛汀新和科素亞治療后DN大鼠的腎臟病理明顯好轉(zhuǎn)，腎臟體積明顯減小(腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯減輕)，足細(xì)胞標(biāo)志物podocin和nephrin的蛋白表達(dá)接近正常水平(雖然本實(shí)驗(yàn)中podocin蛋白表達(dá)的半定量分析顯示組內(nèi)測(cè)量誤差較大，但是每次測(cè)量整體趨勢(shì)一致，且podocin的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與nephrin一致，故可以作為評(píng)估足細(xì)胞損傷情況的佐證)。另外，通過(guò)觀察足細(xì)胞標(biāo)志物podocin和nephrin的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，早期DN大鼠由于腎小球體積增加導(dǎo)致的足細(xì)胞相應(yīng)肥大，足細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)不降反升，但經(jīng)降糖干預(yù)后podocin和nephrin的蛋白表達(dá)水平明顯下降(接近正常水平)，而經(jīng)洛汀新治療大鼠，兩種足細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平又明顯升高，則可能是修復(fù)受損足細(xì)胞的一種表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中我們還觀察到，給予科素亞治療的大鼠(包括單腎切除組和糖尿病腎病模型組)血中AngⅡ水平均明顯升高。其機(jī)制可能為，一方面由于科素亞沒(méi)有非競(jìng)爭(zhēng)性阻斷所有AT1受體［20］，腎小球旁器對(duì)腎素產(chǎn)生的反饋抑制作用消失所致；另一方面，由于DN情況下RAS系統(tǒng)激活，循環(huán)中不斷產(chǎn)生AngⅡ，而科素亞與AT1受體結(jié)合后這些AngⅡ不能與AT1受體結(jié)合故而堆積于循環(huán)中。而不斷積累的AngⅡ一旦與不能被科素亞所阻斷的AT1受體結(jié)合，則可能將進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球足細(xì)胞損傷。

綜上所述，DN情況下腎臟組織中RAS活躍，足細(xì)胞中AngⅡ水平升高，高水平的AngⅡ通過(guò)激活氧化應(yīng)激、Ca2+活性異常及p38 MAPK和caspase-3途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡等途徑導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。而洛汀新和科素亞均可以通過(guò)阻斷RAS系統(tǒng)，阻止AngⅡ在足細(xì)胞中發(fā)揮作用而起到一定的足細(xì)胞保護(hù)作用。而相對(duì)科素亞具有升高AngⅡ水平的作用而言，洛汀新能從源頭上抑制血管緊張素原向AngⅡ的轉(zhuǎn)化，有效地降低循環(huán)中AngⅡ水平，從而展示出更好的足細(xì)胞保護(hù)作用潛力。

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(編輯 韓維棟)

The protective effects of Lotensin and Cozaar on podocytes in diabetic nephropathy rats

XIAO Meng-yun1，WANG Xiao-dan2，HONG Quan2，ZHAO De-long2，YU Lu3(1.Graduate School，Southern Medical University，Guangzhou 510515；2.Department of Nephrology，PLA General Hospital，Beijing 100039；3.Department of Nephrology，No.305 Hospital of PLA，Beijing 100017，China)

ObjectiveTo investigate the effects of angiotensin Ⅱ(AngⅡ)on podocytes in diabetic

nephropathy(DN)rats and observe the protective effects of Lotensin，angiotensin-converting enzyme inhibitor，and Cozaar，angiotensinⅡreceptor blocker，on podocytes in DN rat models.MethodsWe divided 60 rats randomly into 8 groups：normal control group，unilateral nephrectomy group，unilateral nephrectomy+Lotensin group［10 mg/(kg·d)，intragastric administration］，unilateral nephrectomy+Cozaar group［20 mg/(kg·d)，intragastric administration］，diabetic nephropathy group，diabetic nephropathy+insulin injection group(4 U glargine subcutaneous injection twice daily)，diabetic nephropathy+insulin injection+Lotensin group，and diabetic nephropathy+insulin injection+Cozaar group.We modeled the typeⅠDN rats through unilateral(right) nephrectomy+intraperitoneal injection once at a dose of 45 mg/kg STZ.Intervention with Lotensin and Cozaar started after 16 weeks of the rat model construction.The rats were weighed every 4 weeks during the experiment.They were sacrificed at week 8 after the treatment；serum and urine were collected and the kidneys were harvested and weighed.Blood glucose，urine glucose，urine protein/creatinine and angiotensin II were detected.Glomeruli were isolated from one portion of the kidney，while the remaining kidney was prepared for histological study.The expressions of podocin and nephrin in the glomeruli were detected by Western blot analysis.Results①Compared with those in normal control group，blood glucose，urine glucose，and kidney weight/body weight significantly increased(P＜0.01)；weight loss was significant(P＜0.01)in DN groups.Compared with that in DN group，weight increase was significant after treatment with Lotensin and Cozaar(P＜0.05).②In DN group，renal pathology showed early-stage manifestations of DN(mesangial proliferation，increased mesangial matrix，swelling of renal tubular epithelial cells，tubular stenosis，and protein cast).These damages were improved in both Lotensin groups and Cozaar groups.③In Cozaar groups serum Ang II level was raised significantly compared with that in normal control group(P＜0.05).④Protein expressions of podocin and nephrin were up-regulated in both DN group and Lotensin groups compared with those in normal control group(P＜0.05).ConclusionBoth Lotensin and Cozaar can protect podocytes from damage by DN.Cozaar significantly increases serum AngⅡlevel，which makes Lotensin a promising drug in protecting podocytes in early DN.

Lotensin；Cozaar；diabetic nephropathy；podocyte；angiotensinⅡ

R587.1

A

1671-8259(2014)05-0659-06

10.7652/jdyxb201405018

2013-11-27

2014-04-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81370452) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81370452)

喻陸，教授，博士生導(dǎo)師.E-mail：glczcwl@163.com

肖夢(mèng)云(1988-)，女(漢族)，在讀碩士.研究方向：自噬在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制.E-mail：glcaizic@163.com

時(shí)間：2014-07-22 17∶17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1717.015.html