人PIF1及其截短體重組蛋白的真核表達及其細胞內(nèi)定位

李珊珊，劉 旭，張 瑩，王建校，劉曉丹，王 豫，周平坤，顧永清，

◇基礎(chǔ)研究◇

人PIF1及其截短體重組蛋白的真核表達及其細胞內(nèi)定位

李珊珊1，劉 旭1，張 瑩1，王建校1，劉曉丹2，王 豫2，周平坤2，顧永清1，2

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

目的構(gòu)建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT結(jié)構(gòu)域(PIF1N)截短體真核表達重組質(zhì)粒，進行真核表達，并確定PIF1、PIF1C、PIF1N在細胞內(nèi)定位。方法以HeLa cDNA為模板PCR獲取PIF1、PIF1C、PIF1N編碼區(qū)cDNA，將其插入pCMV-Tag 2B質(zhì)粒中構(gòu)建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表達重組質(zhì)粒；通過lipofectamine2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人293細胞中，Western blot方法檢測其在真核細胞內(nèi)的表達，用免疫熒光法檢測其細胞內(nèi)定位。結(jié)果成功構(gòu)建了PIF1及其截短體真核表達重組體，并在真核細胞內(nèi)成功表達。確定PIF1定位于核內(nèi)，PIF1C定位于整個細胞，呈彌散分布，PIF1N主要定位于核內(nèi)。結(jié)論在真核細胞中成功表達了PIF1、PIF1C、PIF1N，且發(fā)現(xiàn)PIF1N對PIF1的入核起重要作用，為進一步研究其PIF1及其各結(jié)構(gòu)域奠定了實驗基礎(chǔ)。

解螺旋酶；PIF1；重組質(zhì)粒；蛋白表達；免疫熒光；真核表達

ression

DNA雙鏈內(nèi)部的堿基序列中存在著大量的生物遺傳信息，幾乎所有的DNA雙鏈都要被瞬間解開形成單鏈，以露出堿基作為模板來進行核酸代謝的過程。而解螺旋酶可誘發(fā)DNA雙鏈解開，是維持基因組穩(wěn)定所必須，在幾乎所有的核酸代謝過程中都有重要作用［1］。解螺旋酶的突變會導(dǎo)致人類遺傳?。?］。PIF1解螺旋酶家族從酵母到人的進化中非常保守，PIF1C具有高度保守性，是一種5'至3'解螺旋酶。PIF1蛋白最早通過參與線粒體DNA的重組而被分離出來。酵母PIF1具有DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)端粒長度、維持DNA復(fù)制和保持遺傳穩(wěn)定性的作用［3-6］。對于人類PIF1蛋白作用的生物化學(xué)機制所知甚少，在生物化學(xué)方面的研究數(shù)據(jù)非常有限。但PIF1解螺旋酶可以參與DNA的損傷修復(fù)。我們的前期研究顯示，PIF1的N末端也有一定的保守性，命名為PINT結(jié)構(gòu)域(PIF1 N-terminal domain)，并且PINT結(jié)構(gòu)域具有與解鏈活性相反的鏈退火活性，使DNA單鏈復(fù)性形成雙鏈，從而使PIF1具有解鏈和復(fù)性這一矛盾的雙重活性［7］，提示PIF1具有重要生理功能。本研究通過構(gòu)建PIF1及其截短體重組質(zhì)粒，并進行表達，旨在研究PIF1功能及其PIF1C、PIF1N對其功能、細胞內(nèi)定位的調(diào)節(jié)作用，為深入研究PIF1功能及分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料p CMV-Tag 2B質(zhì)粒、293細胞均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所實驗室保存；DNA聚合酶：KOD-Plus-Neo、KODFXNeo購自TOYOBO公司；XhoⅠ、HindⅢ內(nèi)切酶、T4連接酶購自Bio Labs公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；DH5α感受態(tài)大腸桿菌、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自TIANGEN公司；DNA凝膠回收試劑盒購自東盛公司；Flag標(biāo)簽抗體購自SIGMA公司；PIF1抗體購自Proteintech公司；PIF1C抗體(自制)［8］，PIF1N(自制)［7］；二抗山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記、二抗山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記購自中杉金橋公司；引物合成與重組質(zhì)粒的測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 PIF1及其截短體cDNA的獲得根據(jù)PIF1蛋白的結(jié)構(gòu)域，分別設(shè)計PIF1(1～1 926)、PIF1C(498～1 926)、PIF1N(1～540)(括號內(nèi)數(shù)字表示核苷酸位置)引物，以He La細胞c DNA為模板，PCR擴增PIF1全長及其截短體片段，引物序列見表1，在上游引物中引入HindⅢ酶切位點，下游引物引入XhoⅠ酶切位點，運行PCR，獲得目的片段。

表1 PIF1及其截短體反應(yīng)體系及擴增條件Tab.1 The reaction system and amplification conditions of PIF1 and its truncated mutants

1.3 重組表達載體的構(gòu)建限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和帶flag標(biāo)簽的p CMVTag 2B載體，凝膠回收純化后，連接目的片段與線性化p CMV-Tag 2B載體，構(gòu)建帶flag標(biāo)簽的PIF1、PIF1C、PIF1N重組融合質(zhì)粒，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.4 真核細胞轉(zhuǎn)染及蛋白提取當(dāng)293細胞(60 mm)密度約60%～80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h，將培養(yǎng)基換成Opti-MEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。質(zhì)粒m/脂質(zhì)體v為2～2.5易于轉(zhuǎn)染，PIF1質(zhì)粒8μg，PIF1C質(zhì)粒4μg，PIF1N質(zhì)粒8μg。將脂質(zhì)體與質(zhì)粒分別加入Opti-MEM培養(yǎng)基中，靜止5 min，后將兩者混勻，靜止20 min，再將混合液輕輕滴入培養(yǎng)液中混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，換正常培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗2～3次，用刮刀刮下細胞，4℃、3 000 r/min，離心5 min。棄上清，留沉淀(細胞)。

加蛋白裂解液60～100μL，冰上裂解10 min， 4℃、12 000 r/min離心10 min。將上清吸入新的EP管中。按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明進行蛋白定量，待Western blot檢測。

1.5 Western blot檢測按40μg總蛋白上樣量，100 g/L SDS-PAGE凝膠濃度電泳，先80 V電泳30 min，調(diào)整電壓為120 V，時間為1 h。20 V恒壓半干轉(zhuǎn)膜(NC膜)30 min，封閉液(50 g/L脫脂奶粉)室溫搖床上孵育1 h。PIF1多克隆抗體(R)、PIFC抗體(R)、PIF1N抗體(R)封閉液稀釋1∶1 000，F(xiàn)lag單克隆抗體(M)封閉液稀釋1∶5 000，Actin內(nèi)參抗體(M)封閉液稀釋1∶1 000，4℃，過夜孵育。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗封閉液稀釋1∶4 000，室溫，搖床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯色檢測PIF1、PIF1C、PIF1N蛋白表達變化。

1.6 免疫熒光分析將瞬轉(zhuǎn)后的細胞玻片置于6孔板中，PBS洗3次，預(yù)冷的40 g/L多聚甲醛4℃固定備用。PBS洗3次，每次5 min，低速震蕩。2.5 mL/LTrinton 100破膜處理，室溫20 min。10 g/L BSA封閉30 min。Flag抗體10 g/L BSA稀釋1∶200，濕盒4℃過夜。PBS洗3次，每次5 min，低速震蕩。二抗10 g/L BSA稀釋1∶1 000，室溫1 h，濕盒避光。PBS洗3次，每次5 min，低速震蕩。核染，PBS稀釋1∶1 000，室溫20 min，濕盒，避光。100 m L/L甘油封片，濕盒避光保存。激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 PIF1及其截短體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以 He La細胞cDNA為模板，PCR擴增PIF1全長、PIF1C和PIF1N cDNA，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，與目的片段大小相符，分別為1 926、1 429、540 bp(圖1A)。PCR產(chǎn)物與帶flag標(biāo)簽的真核表達載體pCMV-Tag 2B經(jīng)HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后，連接轉(zhuǎn)化，行菌落PCR鑒定，陽性候補質(zhì)經(jīng)測序鑒定，證明與GenBank數(shù)據(jù)庫序列完全一致，命名為PIF1、PIF1C、PIF1N。3個帶flag標(biāo)簽的重組融合表達質(zhì)粒被HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后，行瓊脂糖電泳，可見條帶大小與目的片段相符(圖1B)。

圖1 PIF1及其截短體重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant plasmids of human PIF1，its C terminal helicase motif(PIF1C)and N terminal PINT domain(PIF1N)

2.2 PIF1截短體重組蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定將測序正確的PIF1、PIF1C、PIF1N質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染入293細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，細胞行常規(guī)裂解，Western blot檢測PIF1及其截短體蛋白表達。未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染p CMV-Tag 2B空載的293細胞中均未能檢測到條帶(圖2)。PIF1轉(zhuǎn)染細胞，由Flag抗體和商品化PIF1抗體在約70 ku均可檢測到特異蛋白(圖 2A)，與PIF1預(yù)期蛋白大小一致。PIF1C轉(zhuǎn)染細胞，由Flag抗體和自制PIF1C抗體在約55 ku均可檢測到特異蛋白(圖2B)，與PIF1C預(yù)期蛋白大小一致。PIF1N轉(zhuǎn)染細胞，由flag抗體和自制PIF1N抗體在約22 ku均可檢測到特異蛋白(圖2C)，與PIF1N預(yù)期蛋白大小一致。由此可見，構(gòu)建的帶Flag標(biāo)簽的PIF1及其重組體蛋白在真核細胞中得到表達。

圖2 PIF1及其截短體在真核細胞中的表達Fig.2 The expression of PIF1 and its truncated mutants in the eukaryotic cells

2.3 PIF1及其重組體在細胞內(nèi)的定位將測序正確的PIF1、PIF1C、PIF1N質(zhì)粒分別瞬轉(zhuǎn)入293細胞中，F(xiàn)lag標(biāo)簽抗體標(biāo)記，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測PIF1、PIF1C、PIF1N在細胞中的定位(圖3)。未轉(zhuǎn)染細胞Flag抗體標(biāo)記未見熒光信號，說明Flag抗體具有較好的特異性(3A)。PIF1在細胞核內(nèi)表達，呈彌散分布，表達量較高(圖3B)。PIFC定位于整個細胞中，呈彌散分布(圖3C)。PIF1N主要定位于細胞核，細胞核內(nèi)也呈彌散狀分布(圖3D)。

圖3 激光共聚焦免疫熒光檢測PIF1及其截短體在細胞內(nèi)的定位Fig.3 Intracellular location of human PIF1 and its truncated recombinant protein

3 討 論

解螺旋酶因為廣泛參與核酸代謝，在生物體內(nèi)具有非常重要的生理功能。一些解螺旋酶的突變會導(dǎo)致人類遺傳病，包括Werner綜合征(Werner syndrome，WS)、Bloom綜合征(Bloom syndrome，BS)、Rothmund-Thomson綜合征(Rothmund-Thomson syndrome，RTS)等［2］。

DNA解螺旋酶的一個重要特征是在解螺旋酶的一級結(jié)構(gòu)中存在一些高度保守的氨基酸序列，被稱作解螺旋酶模序(helicase motif)，對解螺旋酶的功能起重要作用。PIF1解螺旋酶家族在從酵母到人的進化中非常保守，在其跨越300～500氨基酸范圍的解螺旋酶模序的序列中有高達60%的保守性。既往研究顯示，酵母對基因組穩(wěn)定性的維持具有重要作用，參與DNA損傷修復(fù)、端粒長度調(diào)節(jié)、岡崎片段成熟等眾多生理功能［9-10］。

但人PIF1蛋白的研究起步較晚，對其功能知之甚少。我們前期的研究顯示，PIF1蛋白除了其解螺旋酶模序高度保守以外，其N末端也具有一定的保守性，我們將其命名為PINT(PIF1 N-terminal)結(jié)構(gòu)域［7］。經(jīng)過研究我們還意外地發(fā)現(xiàn)，PIF1N具有非常重要的生理功能，PIF1N能夠促進PIF1對單鏈DNA的結(jié)合從而增加PIF1的解鏈活性，而且PIF1N具有與解鏈相反的使單鏈DNA復(fù)性形成雙鏈的能力，從而使PIF1具有使雙鏈DNA解鏈形成單鏈以及使單鏈DNA復(fù)性形成雙鏈這一矛盾的雙重功能。目前為止，只有引起人類疾病的Rec Q家族的解螺旋酶，如WRN(werner syndrome protein)、BLM(Bloom syndrome protein)和RecQ4等具有解開雙鏈和使單鏈復(fù)性的矛盾的雙重功能，這3種蛋白發(fā)生突變可分別導(dǎo)致Werner綜合征、Bloom綜合征和Rothmund-Thomson綜合征。這3種疾病均以基因組不穩(wěn)定以及易罹患腫瘤為特點。以上結(jié)果提示PIF1具有非常重要的生理功能。

為了研究PIF1解螺旋酶的生理功能，了解其PIF1C、PIF1N的功能及對PIF1的調(diào)節(jié)作用，本研究構(gòu)建了3種PIF1重組質(zhì)粒：PIF1、PIF1C、PIF1N，并在真核細胞中進行了表達。同時激光共聚焦免疫熒光分析了PIF1及其各結(jié)構(gòu)域在細胞中的定位，結(jié)果顯示PIF1全長蛋白位于細胞核，PIF1C彌散定位于整個細胞中，PIF1N位于細胞核。該結(jié)果提示了PIF1N對PIF1的入核具有重要的調(diào)節(jié)作用，沒有PIF1N，PIF1不能入核與DNA結(jié)合發(fā)揮功能。

本研究首次報道PIF1N對其定位的調(diào)節(jié)作用，該結(jié)果揭示了與一般認識相反，PIF1的解螺旋酶模序外的PINT結(jié)構(gòu)域，除賦予PIF1新的生化活性，即退火活性外，還對PIF1的分布具有重要調(diào)節(jié)作用。因此，推測PIF1N還可以通過蛋白間相互作用指導(dǎo)PIF1功能。本研究從分子水平對進一步探討PIF1的功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

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(編輯 國 榮)

The eukaryotic expression and intracellular location of human PIF1 and its truncated recombinant protein

LI Shan-shan1，LIU Xu1，ZHANG Ying1，WANG Jian-xiao1，LIU Xiao-dan2，WANG Yu2，ZHOU Ping-kun2，GU Yong-qing1，2

(1.School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832003；2.Institute of Radiology and Radiation Medicine，the Chinese Academy of Military Medicine，Beijing 100850，China)

ObjectiveTo construct the recombinant eukaryotic expression plasmids of human PIF1，its C terminal helicase motif(PIF1C)and N terminal PINT domain(PIF1N)，and to explore the intracellular location of PIF1，PIF1C and PIF1N.MethodsBy using Hela c DNA as template，the c DNAs encoding PIF1，PIF1C and PIF1N were amplified by PCR and inserted into p CMV-Tag 2B plasmid to construct recombinant plasmids named PIF1，PIF1C and PIF1N.The recombinant plasmids were transfected into 293 cells using lipofectamine 2000.The protein expressions and the intracellular locations of the inserted genes were confirmed by Western blot and immunofluorescence，respectively.ResultsThe recombinant eukaryotic expression plasmid of human PIF1 and its truncated mutants were successfully constructed and transfected into eukaryote cells.PIF1 was located in the nucleus and PIF1C was found in the whole cell and was dispersively distributed，while PIF1N was located in the nucleus.ConclusionPIF1，PIF1C and PIF1N were successfully expressed in eukaryote cells.PIF1N plays a central role in the nucleus entrance of PIF1.The present study provides important experimental evidence for further study on PIF1 and its domains.

helicase；PIF1；recombinant plasmid；protein expression；immunofluorescence；eukaryotic exp

Q78

A

1671-8259(2014)05-0595-04

10.7652/jdyxb201405006

2013-12-25

2014-04-12

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30960093，31160183，31270894)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30960093，31160183，and 31270894)

顧永清，博士，教授.E-mail：yqgu96@163.com；周平坤，博士，教授.E-mail：zhoupk@nic.bmi.ac.cn

李珊珊(1988-)，女(漢族)，碩士，主要研究方向：DNA損傷修復(fù).E-mail：lssttxx@163.com

時間：2014-07-21 18∶00 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140814.1747.001.html