大鼠孤束核內(nèi)GABAA和GABAB受體對心臟傷害性感受相反的調(diào)控作用

劉曉華，韓 曼，楊小立，杜劍青

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院生理教研室，陜西咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院疼痛科，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西西安 710061)

大鼠孤束核內(nèi)GABAA和GABAB受體對心臟傷害性感受相反的調(diào)控作用

劉曉華1，韓 曼1，楊小立2，杜劍青3

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院生理教研室，陜西咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院疼痛科，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西西安 710061)

目的探討大鼠孤束核(nucleus tractus solitarius，NTS)內(nèi)GABAA和GABAB受體對心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的心臟-軀體運動反射(cardiac-somatic motor reflex，CMR)的影響，以闡明NTS內(nèi)GABA能神經(jīng)元在心臟傷害性感受信息傳遞中的作用。方法雄性SD大鼠，以心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的背斜方肌肌電(electromyogram，EMG)活動為CMR的觀測指標(biāo)。在該心臟傷害性感受模型的基礎(chǔ)上，蠅蕈醇組、荷包牡丹堿組、巴氯芬組、CGP組分別在NTS內(nèi)微量注射GABAA和GABAB受體激動劑或拮抗劑，觀測各組給藥前后辣椒素誘發(fā)EMG活動的情況。結(jié)果和給藥前比較，NTS微量注射GABAA受體激動劑蠅蕈醇10或20 mmol，CMR均增加(P＜0.05)；注射拮抗劑荷包牡丹堿10 mmol后，CMR減少(P＜0.05)；注射GABAB激動劑蠅巴氯芬10或20 mmol，CMR均減少(P＜0.05)；注射GABAB拮抗劑CGP 10 mmol后，CMR增加(P＜0.05)。結(jié)論NTS內(nèi)GABAA和GABAB受體對心臟傷害性信息有相反的調(diào)控作用，GABAA有易化作用，而GABAB有抑制作用。

大鼠；孤束核；心臟傷害性刺激；GABA受體；心包內(nèi)注射；辣椒素

位于延髓的孤束核(nucleus tractus solitarius，NTS)在心血管、呼吸以及胃腸道的初級感覺信息的整合和傳遞中有重要作用［1］。研究表明心包腔內(nèi)給予疼痛誘發(fā)物質(zhì)(bradykinin，BK)或者混合致痛劑明顯增加了c-Fos免疫陽性細(xì)胞在NTS內(nèi)的表達(dá)［2］。NTS內(nèi)心臟傳入纖維以谷氨酸作為興奮性遞質(zhì)。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性遞質(zhì)。GABA受體可分

為GABAA、GABAB和GABAC。其中GABAA、GABAB受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而GABAC受體則主要存在于視網(wǎng)膜和視覺通路中。GABA受體激活后通過Cl-內(nèi)流增加(GABAA和GABAC受體)或K+外流增加(GABAB受體)，引起突觸后超極化而產(chǎn)生抑制性突觸后電位。對NTS內(nèi)GABA和谷氨酸能神經(jīng)末梢的超微結(jié)構(gòu)研究顯示GABAA和GABAB受體和外周傳入末梢有緊密的聯(lián)系［3-4］。近期有研究表明，NTS內(nèi)的GABAA和GABAB受體對谷氨酸的釋放有相反的調(diào)控作用［5］。我們的前期研究表明，NTS內(nèi)微量注射谷氨酸對心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的心臟-軀體運動反射(cardiosomatic motor reflex，CMR)有明顯的易化作用。因此，推測NTS內(nèi)GABAA和GABAB受體對心臟傷害性感覺的調(diào)節(jié)作用不同。

本實驗以心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的背斜方肌肌電(electromyogram，EMG)活動為CMR的觀測指標(biāo)。在該心臟傷害性感受模型的基礎(chǔ)上，NTS內(nèi)分別微量注射GABAA和GABAB受體激動劑或拮抗劑，觀測其對辣椒素誘發(fā)EMG活動的影響，探討NTS內(nèi)GABA受體在心臟傷害性感受傳遞和整合中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器和藥品BL-420生物信號采集與分析系統(tǒng)、壓力換能器(成都泰盟生物科技有限公司)；蠕動泵(BT100-2J，保定蘭格恒流泵有限責(zé)任公司)；小動物呼吸機(jī)(DW3000-B型，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；大鼠腦立體定位儀(日本Narishige公司)；Olympus生物顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)

辣椒素溶于吐溫80和無水乙醇(按1∶1的比例混合)溶液中，配制成1×10-3g/m L的貯存液，實驗時用生理鹽水稀釋到所需質(zhì)量濃度1μg/m L。辣椒素、GABAA受體激動劑蠅蕈醇及拮抗劑荷包牡丹堿、GABAB受體激動劑巴氯芬及拮抗劑CGP52432 (CGP)購自英國Tocris公司。

1.2 手術(shù)健康、雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量260～ 330 g。實驗動物稱體質(zhì)量并麻醉(戊巴比妥鈉45～55 mg/kg，i.p)。暴露左側(cè)背斜方肌，以記錄背斜方肌EMG。氣管插管并連接小動物呼吸機(jī)，頸動脈插管監(jiān)測動脈血壓，頸靜脈插管以便在整個實驗過程中維持戊巴比妥鈉的麻醉［10～15 mg/(kg·h)］。實驗中以動脈血壓和瞳孔直徑監(jiān)測實驗動物麻醉深度。

心包插管術(shù)：左側(cè)第一到第三肋軟骨處行開胸術(shù)，暴露胸腺。沿中線分離胸腺，暴露心包膜。在心包膜上開1個小孔，將長12～14 cm、遠(yuǎn)端有數(shù)個小洞的硅膠管(內(nèi)徑0.020 mm、外徑0.037 mm)經(jīng)此孔插入心包約2 cm，縫合胸腺和各層胸壁組織，以固定心包插管。

NTS內(nèi)微量注射：大鼠固定于腦立體定位儀上，暴露枕部腦組織，在閂部水平去除硬腦膜和軟腦膜。NTS內(nèi)微量注射位點以寫翮(第四腦室尾側(cè)最后點)為零坐標(biāo)(前囟后14.3 mm水平)，左側(cè)旁開0.5～0.8 mm，吻側(cè)0～0.5 mm，腦表面下0.5～0.8 mm。微量注射使用尖端與玻璃微電極相連的0.5μL微量注射器(Hamilton，Reno，Nevada，USA)，微電極尖端直徑約50～100μm。NTS內(nèi)微量注射量為0.1 μL，速度為0.1μL/30 s。

1.3 EMG活動的記錄同芯電極以30°的角度插入左側(cè)背斜方肌，心包內(nèi)注射辣椒素同時記錄其EMG信號，根據(jù)肌肉大小調(diào)節(jié)電極插入深度，一般約為1.5～1.7 mm。

1.4 動物分組及處理方法隨機(jī)分為4組，每組n=10，各組大鼠NTS內(nèi)分別微量注射相應(yīng)物質(zhì)。分別為蠅蕈醇組(蠅蕈醇10或20 mmol)、荷包牡丹堿組(荷包牡丹堿10 mmol)、巴氯芬組(巴氯芬10或20 mmol)、CGP組(CGP 10 mmol)。

手術(shù)完畢2～3 h，待動物穩(wěn)定后記錄EMG基線活動60 s，NTS內(nèi)微量注射生理鹽水0.1μL，15 min后，心包腔內(nèi)注射辣椒素(0.655 nmol/0.2 mL)1 min后回抽并沖洗心包4～6次，同時記錄EMG 60～65 s。

50 min后按不同分組，NTS內(nèi)分別注射GABA受體激動劑或拮抗劑，15 min后，心包腔內(nèi)注射辣椒素記錄EMG 60～65 s，以觀察藥物對EMG活動的影響。根據(jù)以往研究，核團(tuán)內(nèi)注射GABA受體激動劑或拮抗劑的作用在50 min左右時消失［6-7］，因此1 h后心包腔內(nèi)注射辣椒素，觀察EMG恢復(fù)情況。

1.5 組織學(xué)定位每只動物實驗結(jié)束后，NTS微量注射位點原位微注射20 g/L膀胺天藍(lán)0.1μL，以標(biāo)記藥物注射位點以及擴(kuò)散范圍。10 min后大鼠靜脈內(nèi)注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)深麻，經(jīng)左心室插管至升主動脈，先用50 m L生理鹽水快速灌注沖洗血液，再用約200 m L的100 m L/L甲醛溶液灌流固定。灌流結(jié)束后取腦組織，放置于100 m L/L的甲醛固定液中室溫固定4 h，再轉(zhuǎn)移到200 g/L的蔗糖溶液中4℃沉糖48 h。待組織沉糖完全后進(jìn)行冰凍切片，片厚30μm，行尼氏染色。顯微鏡下根據(jù)Paxinos and Watson大鼠腦圖譜進(jìn)一步確定注射位點(圖1)。

圖1 NTS內(nèi)微量注射位點圖Fig.1 Microinjection site in the NTS

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，EMG以反應(yīng)中的放電單位總數(shù)計算，以NTS內(nèi)注射生理鹽水后的EMG反應(yīng)為對照，將其定義為100%，計算注射藥物后EMG變化的百分比。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，給藥前后變化的比較采用重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NTS內(nèi)微量注射GABAA受體激動劑對CMR的影響NTS聯(lián)合部微量注射GABAA受體激動劑蠅蕈醇10和20 mmol，15～20 min后觀察其對心包腔內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的背斜方肌的EMG活動的影響。結(jié)果顯示EMG分別為(143.9±10.2)%和(158.9±9.4)%，和給藥前比較均有明顯增加(P＜0.05，表1，圖2)。

表1 各組EMG活動變化的百分率Tab.1 Percentage of EMG activity changes in each group

2.2 NTS內(nèi)微量注射GABAA受體拮抗劑對CMR的影響NTS內(nèi)微量注射GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿10 mmol，以拮抗內(nèi)源性GABA的功能，觀察NTS內(nèi)GABAA受體是否對心臟傷害性感受有緊張性調(diào)控作用。結(jié)果顯示，EMG活動為(66.2±12.3)%，和給藥前比較明顯下降(P＜0.05，表1，圖2)。

2.3 NTS內(nèi)微量注射GABAB激動劑對CMR的影響NTS聯(lián)合部微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬10和20 mmol，15～20 min后觀察其對心包腔內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的背斜方肌的EMG活動的影響。結(jié)果顯示EMG分別為(45.2±10.6)%和(36.8± 14.3)%，和給藥前比較均有明顯的減少(P＜0.05，表1，圖2)。

2.4 NTS內(nèi)微量注射GABAB拮抗劑對CMR的影響NTS內(nèi)微量注射GABAB受體拮抗劑CGP 10 mmol，以拮抗內(nèi)源性GABA的功能，觀察NTS內(nèi)GABAB受體是否對心臟傷害性感受有緊張性調(diào)控作用。結(jié)果顯示，EMG活動為(143.2±15.3)%，和給藥前比較明顯增加(P＜0.05，表1，圖2)。

圖2 各組藥物對CMR影響的EMG變化Fig.2 Changes of EMG activities after intra-NTS injection of different drug

3 討 論

以往研究表明心臟感覺傳入神經(jīng)纖維至少通過兩條通路上傳到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，即伴隨心交感神經(jīng)的傳入纖維和伴隨心迷走神經(jīng)的傳入纖維［8］。迷走傳入神經(jīng)纖維直接投射到位于延髓的NTS［9］。束路追蹤研究表明心臟交感傳入神經(jīng)纖維在脊髓頸部和胸部背角換元后也有部分投射纖維終止于NTS［10-11］。免疫組織化學(xué)研究表明，心包內(nèi)注射化學(xué)致痛劑可以誘發(fā)c-Fos在NTS內(nèi)的表達(dá)［2］。這些結(jié)果提示NTS是心臟傷害性感覺信息傳遞的重要驛站。

內(nèi)臟傳入纖維在NTS內(nèi)主要以谷氨酸為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性中間神經(jīng)元，對NTS內(nèi)神經(jīng)元的功能起重要的調(diào)節(jié)作用［12］。對NTS內(nèi)GABA和谷氨酸能神經(jīng)末梢的超微結(jié)構(gòu)研究顯示GABA能神經(jīng)元和外周傳入末梢有緊密的聯(lián)系。電鏡下發(fā)現(xiàn)，NTS內(nèi)辣根過氧化物酶逆行追蹤的迷走傳入纖維與GABA免疫陽性神經(jīng)元有突觸聯(lián)系［13］；放射自顯影技術(shù)研究表明NTS內(nèi)GABAA受體在大鼠的迷走傳入神經(jīng)元的胞體和末梢均有表達(dá)［14］。激活突觸前的GABAA受體即可以通過易化神經(jīng)遞質(zhì)的釋放也可以通過抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［15-16］。近期研究表明，NTS內(nèi)的GABAA和GABAB受體對谷氨酸的釋放有相反的調(diào)控作用，GABAA可以使谷氨酸能興奮性突觸后電位增加，而GABAB則使其減?。?］。這些結(jié)果提示NTS內(nèi)的GABA能神經(jīng)元可以通過對心臟感覺傳入末梢谷氨酸釋放的調(diào)控而實現(xiàn)對心臟傷害性感覺傳遞的調(diào)控。

在本實驗中，NTS聯(lián)合部微量注射選擇性的GABAA和GABAB受體激動劑，對心包腔內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的EMG反應(yīng)產(chǎn)生相反的調(diào)控作用，GABAA受體的激活對心臟傷害性信息有明顯的易化作用，而GABAB受體有明顯的抑制作用。這一結(jié)果提示，GABA能神經(jīng)元對心臟傷害性感覺的調(diào)控是雙向的，根據(jù)作用的受體不同，產(chǎn)生不同的作用。我們以往的研究證明，NTS聯(lián)合部注射谷氨酸對心臟傷害性感覺有易化作用［17］，因此GABA能不同受體的作用，可能與其對谷氨酸釋放的不同作用有關(guān)。GABAA的易化作用可能主要依賴于其對谷氨酸釋放的易化作用，GABAB對NTS內(nèi)谷氨酸釋放的抑制進(jìn)而使心臟傷害性信息的傳遞受到抑制。

為了進(jìn)一步明確不同的GABA受體對心臟傷害性感受是否有緊張性調(diào)控作用。實驗中單獨注射受體拮抗劑，觀察對心臟傷害性反射的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和激動劑的效應(yīng)一直，GABAA受體拮抗劑對心臟傷害性信息有明顯的抑制作用，而GABAB受體有明顯的易化作用。該項結(jié)果提示GABAA和GABAB受體在心臟傷害性信息的傳遞中均有緊張性調(diào)控作用。免疫組織化學(xué)研究表明［18］，NTS內(nèi)神經(jīng)元的胞體和末梢均有GABA能免疫陽性表達(dá)。因此，對于NTS內(nèi)GABA能神經(jīng)元對谷氨酸遞質(zhì)釋放的調(diào)控，是GABA能抑制性中間神經(jīng)元的局部作用，還是GABA能下行投射纖維的作用，還需進(jìn)一步證明。

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(編輯 國 榮)

GABAAand GABABreceptors oppositely modulate cardiac nociception in rat nucleus tractus solitarius

LIU Xiao-hua1，HAN Man1，YANG Xiao-li2，DU Jian-qing3
(1.Department of Physiology，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046；2.Department of Pain，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3.Department of Physiology and Pathophysiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo explore the effects of GABAAand GABABreceptors in rat nucleus tractus solitarius (NTS)on cardiac-somatic motor reflex(CMR)induced by intra-pericardiac injection of capsaicin to clarify the role of GABAAand GABABreceptors in cardiac nociception.MethodsMale SD rats were used for recording spinotrapezius muscle electromyogram(EMG)activity induced by intra-pericardiac injection of capsaicin as the index of CMR.Intra-NTS microinjection of GABAAreceptor agonist or antagonist was given to muscimol，bicuculline，baclofen and CGP groups.Then we compared the changes of EMG activities before and after drug administration in each group.ResultsCMR increased after intra-NTS microinjection of GABAAreceptor agonist muscimol 10 or 20 mmol as compared with pre-drug administration(P＜0.05).After injection of GABAAreceptor antagonist bicuculline 10 mmol，CMR decreased(P＜0.05).After injection of GABABreceptor agonist baclofen 10 or 20 mmol，CMR decreased(P＜0.05).Injection of GABABreceptor antagonist CGP made CMR increased(P＜0.05).ConclusionGABAAand GABABreceptors oppositely modulate cardiac nociception in the rat NTS，with the former playing a facilitatory role and the latter playing an inhibitory role.

rat；nucleus tractus solitarius；cardiac nociception；GABA receptor；intra-pericardiac injection；capsaicin

R338.2

A

1671-8259(2014)05-0591-04

10.7652/jdyxb201405005

2014-01-21

2014-04-10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.31171068) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.31171068)

杜劍青，博士，教授，博士生導(dǎo)師.E-mail：dujianq@mail.xjtu.edu.cn

劉曉華(1980-)，女(漢族)，講師，博士.研究方向：痛覺的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制.E-mail：rosemadam@163.com

時間：2014-07-22 16∶13 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1613.002.html