內生大麻素受體激動劑抑制異動癥大鼠紋狀體單胺類神經遞質的釋放

王 勇，張格娟，王 濤，王會生，劉 健

(西安交通大學醫(yī)學院生理學與病理生理學系，陜西西安 710061)

內生大麻素受體激動劑抑制異動癥大鼠紋狀體單胺類神經遞質的釋放

王 勇，張格娟，王 濤，王會生，劉 健

(西安交通大學醫(yī)學院生理學與病理生理學系，陜西西安 710061)

目的觀察內生大麻素受體激動劑WIN 55，212-2對帕金森病左旋多巴相關異動癥模型大鼠紋狀體內單胺類神經遞質釋放的影響。方法采用腦內微透析和高效液相色譜在線遞質測量法觀察WIN 55，212-2腹腔內注射對異動癥模型大鼠左旋多巴相關異動癥狀和紋狀體內單胺類神經遞質釋放的影響。結果與溶劑注射相比，WIN 55，212-2注射顯著抑制異動癥模型大鼠左旋多巴皮下注射后的異動樣癥狀(F1263=44.071，P＜0.001)，同時明顯減少紋狀體內多巴胺的釋放(F1263=5.091，P＜0.05)。結論紋狀體內生大麻素受體可能通過抑制性的調節(jié)單胺類神經遞質的釋放來影響異動癥模型大鼠的異動樣癥狀。

帕金森??；異動癥；紋狀體；多巴胺；去甲腎上腺素；大鼠；大麻素受體激動劑

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種臨床常見的中樞神經系統(tǒng)變性疾病［1］。PD的基礎病理改變是腦內多巴胺(dopamine，DA)及去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)能神經元變性缺失和紋狀體內單胺類神經遞質含量降低［2］。左旋多巴(L-3，4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)是單胺類神經遞質合成的前體物質，在腦內可以通過特定的酶促反應轉化為DA和NE等神經遞質［3］。L-DOPA是目前臨床治療PD的最常用藥物［4］。PD患者長期服用LDOPA后通常會出現(xiàn)L-DOPA相關的異動癥(LDOPA-induced dyskinesia，LID)。LID的出現(xiàn)會嚴重影響PD患者的生活質量［5-6］。闡明LID的病理生理機制和有效控制LID樣癥狀是目前PD基礎和臨床研究的重要課題［4］。新近在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，內生大麻素受體激動劑可以明顯抑制LID動物模型的LID樣癥狀，但其具體機制尚未闡明［7］。本實驗通過給LID模型大鼠腹腔內注射內生大麻素受體激動劑WIN 55，212-2(WIN)，同時采用腦內微透析和高效液相色譜在線遞質測量法觀察WIN注射對LID大鼠紋狀體內單胺類神經遞質釋放的影響，探討內生大麻素受體激動劑治療LID的神經生物學機制。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品20只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(220～250 g)，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。大鼠在標準環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫20～25℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水，預養(yǎng)1周。LDOPA(L-3，4-dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride)、芐絲肼(benserazide hydrochloride)、6-OHDA(6-Hydroxydopamine hydrobromide)、WIN (WIN 55，212-2 mesylate salt)購自Sigma公司(Sigma-Aldrich，MO，USA)。

1.2 大鼠PD模型制備大鼠在40 g/L水合氯醛(400 mg/kg，i.p.)麻醉下進行內側前腦束(medial forebrain bundle，MFB)內6-OHDA注射。將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上(SN-2N，Narishige)，嚴格顱平位。術前先給大鼠注射地昔帕明(25 mg/kg，i.p.)以保護NE能神經元。依據(jù)Paxinos-Watson大鼠腦定位圖譜確定左側MFB三維坐標位置是前囟后AP 4.0 mm；矢狀縫左L 1.2 mm；顱骨膜下D 7.7 mm［8］。6-OHDA溶于含0.2 g/L抗壞血酸的生理鹽水中，用前配制，4℃避光保存。微量注射使用尖端與玻璃微電極相連的10μL Hamilton微量注射器，在MFB內注射6-OHDA，總量12μg/4μL，給藥速度1μL/min，注射完畢后將玻璃微電極留置5 min后緩慢退出。6-OHDA注射后第14天，對大鼠分別進行阿撲嗎啡(0.05 mg/kg，s.c.)誘導的旋轉試驗。接受阿撲嗎啡注射后，5 min內對側旋轉大于20圈的大鼠被視為成功的PD模型。

1.3 L-DOPA注射和行為學檢測檢測成功的PD模型大鼠接受1次/d，共21 d的L-DOPA和芐絲肼注射。L-DOPA(6 mg/kg，s.c.)和芐絲肼(12 mg/kg，s.c.)于臨用前溶于生理鹽水［9］。在L-DOPA注射的第21天，通過異動癥評分(abnormal involuntary movements，AIMs)來選取成功的LID大鼠模型。AIMs評分在L-DOPA注射后180 min內每10 min進行1次，共19次。包括軀干、上肢、口舌和對側旋轉等4項異動樣癥狀的累計評分。根據(jù)癥狀程度從輕到重每項癥狀的評分可為0～4分(無：0分；異動癥狀出現(xiàn)時間短于觀測時間的50%：1分；癥狀出現(xiàn)時間長于觀測時間的50%：2分；異動癥狀持續(xù)出現(xiàn)：3分；異動癥狀持續(xù)出現(xiàn)且不被外來感覺刺激打斷：4分)。每觀測時間點的最高評分為16分，總分為304分［10］。經檢測，表現(xiàn)出明顯LID樣癥狀的大鼠被納入進一步實驗。

1.4 WIN 55，212-2的亞慢性注射經檢測成功的LID模型大鼠被隨機分為WIN注射組(n=6)和對照組(VEH，n=6)。從第22天到第24天WIN組和VEH組大鼠在L-DOPA注射前20 min分別接受1次/d，連續(xù)3 d的WIN(1 mg/kg，i.p.)或空白溶劑(VEH，5%/5%/90%of Tween 80/PEG/saline)注射［7］。在第24天觀察WIN對異動癥模型大鼠AIMs評分和紋狀體內DA和NE神經遞質釋放的影響。

1.5 腦內微透析液采集和遞質含量的測定在LDOPA注射的第21天，大鼠在40 g/L水合氯醛(400 mg/kg，i.p.)麻醉下進行微透析導管植入手術。微透析導管(CMA/12，CMA Microdialysis，Kista，Sweden)被植入左側紋狀體內(AP+0.6 mm，L 3.5 mm，D 3.5 mm)并使用2個不銹鋼螺釘和玻璃離子體水門汀將導管固定于顱骨上［8，11］。術后將大鼠單籠飼養(yǎng)，在微透析液采集的前1 d將微透析探針(CMA 12 MD Elite Probe，4 mm membrane length，CMA Microdialysis，Kista，Sweden)置入套管內［12］。在WIN注射的第3天進行微透析液采集。將大鼠置入清醒動物用微透析液采集桶(CMA 120，CMA Microdialysis，Kista，Sweden)內。使用聚乙烯軟管連接微透析探針和微透析泵(CMA 402 Syringe Pump，Kista，Sweden)，并使用林格液(147 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L CaCl2和0.85 mmol/L MgCl2)充灌整個微透析系統(tǒng)［13］。微透析速度為1.5μL/min，每10 min收集1個透析樣品。首先收集3個透析樣品作為前對照，之后進行L-DOPA注射(6 mg/kg，加芐絲肼12 mg/kg，s.c.)。L-DOPA注射后每10 min收集1個透析樣品并記錄實時的AIMs評分，共進行180 min的透析樣品采集。微透析液收集完畢的大鼠在過量麻醉后，經左心室灌注生理鹽水100 m L，隨后用40 g/L多聚甲醛150 m L灌注固定；取腦連續(xù)冠狀面冷凍切片，確定透析管的置入位置。并行黑質致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫組織化學染色確定DA能神經元的毀損程度［14］。將采集到的透析液注入HPLC(AlexysUhplc，Antec，Zoeterwoude，the Netherlands)系統(tǒng)中實時測定透析液中的DA和NE遞質含量，并換算出腦內DA和NE的實際含量。我們在實驗中還分別采集了DA和NE含量在L-DOPA注射后的峰值(ΔCmax)、峰值出現(xiàn)時間(Tmax)和峰值半衰期(t1/2)，這些代謝動力學參數(shù)反映了L-DOPA注射后紋狀體內DA和NE代謝速度的變化。

1.6 統(tǒng)計學分析TH染色陽性神經元計數(shù)、DA和NE代謝動力學參數(shù)的比較使用t檢驗。L-DOPA注射后不同組動物間AIMs分值和遞質含量水平的比較使用雙因素重復測量方差分析(Two-way RMANOVA)的方法統(tǒng)計，post hoc檢驗使用Holm-Sidak檢驗。使用SigmaStat 3.5軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

SNc內TH染色陽性神經元計數(shù)顯示，MFB內6-OHDA注射后，大鼠毀損側SNc內TH染色陽性神經元顯著減少至對側的(2±3)%(P＜0.001，t檢驗，圖1)。

圖1 單側SNc損毀大鼠SNc內TH免疫組織化學染色顯微圖片F(xiàn)ig.1 Photomicrographs of TH immunocytochemical slices that showed the staining of the SNc in a 6-OHDA-lesioned rat

19只檢測成功的6-OHDA損毀大鼠在接受21 d L-DOPA注射后有12只大鼠表現(xiàn)出典型的LID樣癥狀，納入LID組做進一步實驗。另外7只6-OHDA損毀大鼠無典型的LID癥狀，為non-LID大鼠(圖2A～D)。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，LID和non-LID組大鼠AIMs評分在組間(F1398= 331.086，P＜0.001)、不同時間點(F20398=99.980，P＜0.001)及時間×組間交互作用(F20398=93.867，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學差異。使用Holm-Sidak法進一步的比較不同時間點組間差異，結果顯示LDOPA注射后有15個時間點LID組和non-LID組AIMs評分有統(tǒng)計學差異(圖2E)。

納入LID組的12只大鼠被隨機分為WIN注射組(n=6)和VEH注射組(n=6)，接受3 d的藥物注射。在第3天比較兩組AIMs評分和紋狀體內DA與NE釋放水平的差異。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，WIN和VEH組大鼠AIMs評分在組間(F1263=44.071，P＜0.001)、不同時間點(F21263= 150.448，P＜0.001)及時間×組間交互作用(F21263=14.354，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學差異。使用Holm-Sidak法進一步比較不同時間點組間差異，結果顯示L-DOPA注射后有12個時間點WIN組和VEH組AIMs評分有統(tǒng)計學差異(圖3A)。

圖2 L-DOPA注射后LID大鼠的異動樣行為Fig.2 Effects of L-DOPA administration on rat dyskinetic behavior

L-DOPA注射后WIN組和VEH組大鼠DA與NE釋放均明顯增加。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，WIN和VEH組大鼠紋狀體DA水平在組間(F1263=5.091，P＜0.05)、不同時間點(F21263= 31.029，P＜0.001)及時間×組間交互作用(F21263= 6.091，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學差異。使用Holm-Sidak法進一步比較不同時間點組間差異，結果顯示L-DOPA注射后有6個時間點WIN組和VEH組DA水平有統(tǒng)計學差異(圖3B)。DA代謝動力學參數(shù)中ΔCmax和t1/2在WIN組和VEH組有統(tǒng)計學差異(圖3D～F)。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，WIN和VEH組大鼠紋狀體NE水平在組間無統(tǒng)計學差異(F1263=0.195，P＞0.05)，但不同時間點(F21263= 13.657；P＜0.001)及時間×組間交互作用(F21263= 2.560，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學差異。使用Holm-Sidak法進一步比較不同時間點的組間差異，結果顯示L-DOPA注射后有2個時間點WIN組和VEH組的NE水平有統(tǒng)計學差異(圖3C)。NE代謝動力學參數(shù)中Tmax和t1/2在WIN組和VEH組有統(tǒng)計學差異(圖3D～F)。

圖3 WIN對LID大鼠AIMs評分和紋狀體內DA與NE釋放的影響Fig.3 Effects of WIN on AIMs score and extracellular DA and NE release in LID rats

3 討 論

本實驗結果顯示，多數(shù)6-OHDA損毀的PD模型大鼠在接受21 d的L-DOPA慢性注射后會出現(xiàn)與LID患者類似的不自主運動癥狀，這與以往的文獻報道一致。LID的主要癥狀包括了軀干、上肢、口面舌的不自主運動，對于偏側的LID模型大鼠還會出現(xiàn)不自主的對側旋轉運動［10］。PD患者和PD模型動物出現(xiàn)LID的原因目前尚未完全闡明。目前的研究顯示，LID的出現(xiàn)與紋狀體內的突觸可塑性改變密切相關。這種改變涉及到紋狀體內突觸前膜和突觸后膜的一系列變化。PD狀態(tài)下，由于DA和NE等單胺能傳入纖維的損毀，使LID模型動物的紋狀體突觸前末梢對單胺類遞質的存儲和清除能力下降。在接受L-DOPA注射后會出現(xiàn)紋狀體內DA等遞質水平的驟升和驟降過程，這一現(xiàn)象與LID的出現(xiàn)密切相關［9］。在紋狀體內的突觸后膜上有DA能D1受體表達。有研究顯示，紋狀體內單胺類遞質的動態(tài)變化會對突觸后膜的D1等相關受體產生病理性的刺激。有研究報道，LID模型動物的紋狀體內D1受體m RNA表達上調，D1受體調節(jié)的胞內G蛋白信號通路也表現(xiàn)活性上調。外源性的給予D1類受體激動劑可以抑制LID樣癥狀。除了單胺能和谷氨酸能遞質系統(tǒng)外，內生大麻素遞質系統(tǒng)可能在LID的出現(xiàn)過程中發(fā)揮重要作用［15］。紋狀體內的突觸后細胞可以合成內源性類大麻素遞質N-花生四烯酸氨基乙醇(N-arachidonoylethanolamine，AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)。這類遞質可以作用于紋狀體突觸前膜的內生大麻素CB1受體，進而抑制突觸前遞質的釋放。有研究顯示，CB1受體結合類遞質上調的小鼠在同樣接受L-DOPA處理時LID癥狀較正常小鼠顯著減輕。LID大鼠接受CB受體激動劑后其LID樣癥狀也會出現(xiàn)顯著減輕［4］。這些結果都提示，內生大麻素遞質系統(tǒng)參與LID的產生過程，CB受體激動劑可能成為治療或控制LID癥狀的藥物。CB受體激動劑減輕LID癥狀的機制目前仍不清楚。在本研究中，我們通過建立LID大鼠模型，觀察其在接受CB受體激動劑WIN后紋狀體單胺類遞質釋放的改變，并探討CB受體激動劑抑制LID癥狀的作用機制。實驗結果顯示，CB受體激動劑WIN可以顯著抑制L-DOPA注射后紋狀體內DA和NE遞質的釋放過程。而且，這一過程與AIMs評分的下降時相一致。CB受體激動劑對DA和NE釋放的抑制可能與其對單胺能突觸前末梢的抑制作用有關。表達于紋狀體突觸前的CB受體為抑制性受體，該受體興奮時可抑制突觸前膜的興奮過程，進而抑制突觸前遞質的釋放［16］。由于LID的出現(xiàn)與L-DOPA注射后突觸前膜DA等遞質的短時大量釋放有關，因而，CB受體激動劑WIN對LID樣癥狀的抑制作用可能與其對L-DOPA注射后紋狀體內DA和NE等單胺類遞質釋放的抑制有關。

綜上所述，本研究結果提示CB受體激動劑類藥物可能通過抑制L-DOPA給予后紋狀體內單胺類遞質的峰釋放過程，進而抑制LID樣癥狀的出現(xiàn)。

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(編輯 韓維棟)

Cannabinoid receptor agonist WIN 55，212-2 inhibits striatal monoamine release in a rat model of L-DOPA-induced dyskinesia

WANG Yong，ZHANG Ge-juan，WANG Tao，WANG Hui-sheng，LIU Jian (Department of Physiology&Pathophysiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo explore the effects of cannabinoid receptor agonist WIN 55，212-2 on striatal monoamine release in a rat model of L-DOPA-induced dyskinesia(LID).MethodsEffects of WIN 55，212-2 on striatal monoamine release in LID rats were observed by intracerebral microdialysis and high-performance liquid chromatography.ResultsThe dyskinetic behavior related to L-DOPA was inhibited significantly by the injection of cannabinoid receptor agonist WIN 55，212-2(F1263=44.071，P＜0.001)，accompanied by significant decrease of striatal dopamine release(F1263=5.091，P＜0.05).ConclusionThe Results suggest that cannabinoid receptor may be involved in mediating the dyskinetic behavior related to L-DOPA through the regulation of striatal monoamine release.

Parkinson's disease；dyskinesia；striatum；dopamine；norepinephrine；rat；cannabinoid receptor agonist

R741

A

1671-8259(2014)05-0586-05

10.7652/jdyxb201405004

2014-03-22

2014-04-25

國家自然科學基金資助項目(No.81100837)；中國博士后科學基金(No.2013M532059) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81100837)and China Postdoctoral Science Foundation(No. 2013M532059)

劉健，教授.E-mail：liujian@mail.xjtu.edu.cn

王勇(1978-)，男(漢族)，生理學博士，主要從事帕金森病的病理生理學研究.E-mail：yongwang@mail.xjtu.edu.cn

時間：2014-07-22 18∶22 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1822.021.html