2種培養(yǎng)基對碳青霉烯類藥物抗非發(fā)酵菌體外藥敏檢測結(jié)果的影響

金波+葉巖榮

摘 要 目的：評估低氨基酸培養(yǎng)基和MH培養(yǎng)基對碳青霉烯類藥物抗非發(fā)酵菌體外藥敏檢測結(jié)果的區(qū)別。方法：采用瓊脂稀釋法分別使用MH和低氨基酸培養(yǎng)基測定亞胺培南、美羅培南、帕尼培南等10種抗菌藥物對我院臨床分離60株銅綠假單胞菌和140株鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度（MIC），比較其結(jié)果的差異。結(jié)果：使用MH瓊脂作為藥敏培養(yǎng)基時，60株銅綠假單胞菌和140株鮑曼不動桿菌對亞胺培南、美羅培南和帕尼培南的敏感率分別為90%、85%和68.3%和15.7%、23.6%和15%；使用低氨基酸瓊脂作為藥敏培養(yǎng)基時，它們的敏感性分別上升到100%（P=0.272）、96.7%（P=0.053）、93.3%（P=0.001）和90.7%（P=0.001）、98.6%（P=0.001）和91.4%（P=0.001），其中銅綠假單胞菌對帕尼培南的敏感率上升有顯著差異，而鮑曼不動桿菌對三者的敏感率上升均有顯著差異。結(jié)論：我院分離的鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率較高。碳青霉烯類藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的抗菌活性高于其它類抗菌藥物。低氨基酸培養(yǎng)基，由于其堿性氨基酸濃度降低至與人血清中相近的濃度，適宜用于帕尼培南體外敏感性測定。

關(guān)鍵詞 碳青霉烯類 非發(fā)酵菌 體外藥敏 低氨基酸培養(yǎng)基

中圖分類號：R446.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1006-1533（2014）11-0019-04

Evaluation of the susceptibility of clinical

non-fermentative isolates to carbapenems on two kinds of media

JIN Bo*， YE Yanrong**

（Department of Pharmaceutical Preparation， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the effects of low-amino-acid agar and Mueller-Hinton （MH） agar on the susceptibility of clinical non-fermentative isolates to three carbapenems. Methods： The activities of imipenem， meropenem， panipenem and so on were tested against 40 Pseudomonas aeruginosa and 160 Acinetobacter baumannii strains isolated from our hospital. The minimum inhibitory concentration （MIC） of each antimicrobial agent against these strains was determined by a standard agar dilution procedure on the MH and low-amino-acid agars， respectively. Results： The susceptibility of P. aeruginosa and A. baumannii to imipenem， meropenem， panipenem was 90%， 85%， 68.3% and 15.7%， 23.6% ， 15%， respectively when they were incubated on MH agar， however， their susceptibility was enhanced to 100% （P=0.272）， 96.7% （P=0.053）， 93.3% （P=0.001）and 90.7% （P=0.001）， 98.6% （P=0.001） and 91.4% （P=0.001） on low-amino-acid agar， respectively， which were statistically significant. Conclusion： Carbapenems had good antibacterial activity in vitro against P. aeruginosa and A. baumannii. Low concentrations of basic amino acid medium should be used in order to get consistent result between in vitro susceptibilities and clinical effect of panipenem against P. aeruginosa..

KEY WORDS carbapenems； non-fermentative isolates； in vitro susceptibilities； low-amino-acid agar

碳青霉烯類抗菌藥物于20世紀(jì)90年代初開始用于臨床，由于其對β內(nèi)酰胺酶較強(qiáng)的穩(wěn)定性，對幾乎所有的腸桿菌科細(xì)菌具強(qiáng)大的抗菌作用，是治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC）等多重耐藥革蘭陰性桿菌包括某些非發(fā)酵菌所致感染的重要藥物[1]。但近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類菌株、特別是非發(fā)酵菌耐藥菌株的不斷增加，給臨床治療帶來極大的困難，而采用不同的培養(yǎng)基測試它們的藥敏結(jié)果有不小差異[2]。為確切了解在我院目前碳青霉烯類與其它常用的抗菌藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性，我們在MH培養(yǎng)基上分別對臨床分離的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌檢測了最低抑菌濃度（MIC），并對在2種不同培養(yǎng)基上測試的三種碳青酶烯類抗菌藥物的抗菌活性進(jìn)行了比較，為臨床正確評價(jià)不同培養(yǎng)基上測試的藥敏結(jié)果和合理選用抗菌藥物提供依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 菌株

收集我院2010年1-9月不同標(biāo)本來源的臨床革蘭陰性非發(fā)酵分離株200株作為受試菌株，其中銅綠假單胞菌60株、鮑曼不動桿菌140株。所有分離株都由鳳凰全自動細(xì)菌鑒定藥敏儀（Phoenix System，美國BD）鑒定通過。質(zhì)控菌株采用大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27953（購自上海市臨床檢驗(yàn)質(zhì)控中心）。

1.2 抗菌藥物

本研究所測試的10種抗菌藥物均為標(biāo)準(zhǔn)品（購自中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 培養(yǎng)基

MH培養(yǎng)基（購自英國Oxoid）作為目前臨床微生物使用的常規(guī)藥敏培養(yǎng)基；Davis 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（minimal agar Davis，購自美國BD）和酸 水解酪蛋白（ 購自美國Sigma）作為低氨基酸瓊脂培養(yǎng)基，其配制方法為每升Davis基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入4.5 g酸水解酪蛋白；哥倫比亞血平板（購自法國梅里埃）為細(xì)菌純化分離培養(yǎng)基。

1.4 藥敏試驗(yàn)方法

MIC測定采用瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)[3]。受試菌株均在血平板上傳代1次，保證其純度及活力，挑取單個菌落接種于90 mm的血平板上，用接種環(huán)涂布于整個平板，置于含5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱于35 ℃孵育18 h。試驗(yàn)當(dāng)日將生長的菌落懸浮于2 ml 0.85%滅菌生理鹽水中，制備濃度為0.5個麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙骸Ｏ♂尯笫褂枚帱c(diǎn)接種儀將約1～2 ?l菌懸液點(diǎn)種在含有不同濃度抗菌藥物的平板上，不加抗菌藥物的平板作為陽性對照，細(xì)菌的最終接種濃度為104 CFU/點(diǎn)。所有平板置于含5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱于35 ℃孵育18 h觀察結(jié)果。

1.5 結(jié)果判讀方法

肉眼觀察細(xì)菌生長結(jié)果，與陽性對照比較抑制80%以上細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為該藥的MIC值[3]。

1.6 數(shù)據(jù)計(jì)算和分析

根據(jù)MIC值，采用Whonet 5.4藥敏統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算MIC50、MIC90、耐藥率、中敏率和敏感率，其中藥敏結(jié)果折點(diǎn)參考2012年版CLSI，M100-S22[4]，帕尼培南的判斷折點(diǎn)參考文獻(xiàn)[5]，頭孢哌酮/舒巴坦判斷折點(diǎn)參考頭孢哌酮[5]。

2 結(jié)果

2.1 在MH培養(yǎng)基上體外抗菌活性

10種抗菌藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性見表1。

2.2 在低氨基酸培養(yǎng)基上的體外抗菌活性

低氨基酸培養(yǎng)基能提高碳青霉烯類的抗菌活性，3種碳青霉烯類藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性見表2。使用卡方檢驗(yàn)分析，銅綠假單胞菌對帕尼培南的敏感率顯著上升，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；鮑曼不動桿菌對三種碳青霉烯類藥物的敏感率均顯著上升，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

銅綠假單胞菌對碳青霉烯類的主要耐藥機(jī)制，包括產(chǎn)生外排泵、獲得編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因和外膜通透性降低等。OprD是銅綠假單胞菌外膜上堿性氨基酸的結(jié)合位點(diǎn)，能夠加速堿性氨基酸的擴(kuò)散。由于碳青霉烯類在結(jié)構(gòu)上與堿性氨基酸相似，因此OprD也是碳青霉烯類進(jìn)入銅綠假單胞菌的通道。OprD缺失會主要導(dǎo)致這兩種細(xì)菌對亞胺培南耐藥，但對美羅培南敏感性的降低程度比較有限[6].

國外有研究表明降低MH瓊脂培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)氨基酸濃度可以增強(qiáng)銅綠假單胞菌外膜D2孔蛋白通道運(yùn)送碳青霉烯類抗菌藥的能力，有利于其進(jìn)入細(xì)菌從而提高抗銅綠假單胞菌活性[6]。Fukuoka等[7]報(bào)道，帕尼培南和亞胺培南在人血清中抗假單胞菌的活性遠(yuǎn)高于MH培養(yǎng)基，而在人血清中加入堿性氨基酸，其活性則會顯著降低。Muramatsu等[8]研究表明，帕尼培南、亞胺培南和美羅培南中帕尼培南的MIC受堿性氨基酸影響最大。蕭晨路等[9]研究發(fā)現(xiàn)低氨基酸培養(yǎng)基能夠增強(qiáng)碳青霉烯類尤其是帕尼培南的抗假單胞菌的活性，而目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室通常采用的藥敏培養(yǎng)基MH會降低銅綠假單胞菌對帕尼培南的體外敏感性，本研究證實(shí)這一結(jié)果，其中帕尼培南的抗菌效果上升顯著，銅綠假單胞菌在低堿培養(yǎng)基中對帕尼培南的耐藥率及MIC50/MIC90分別為0%和（0.032/2）。本研究還發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌在低氨基酸的培養(yǎng)基中對碳青霉烯類藥物的敏感性也顯著上升，這與國外研究結(jié)果相差較大，是否和本院分離的鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制獨(dú)特性有關(guān)，需進(jìn)一步研究證實(shí)原因。

綜上所述，由于目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室通常采用的藥敏培養(yǎng)基MH中含有高濃度的堿性氨基酸，會對碳青霉烯類藥物，尤其是帕尼培南的體外藥敏檢測結(jié)果造成影響，因此可能需要根據(jù)測試細(xì)菌的種類對藥敏培養(yǎng)基中堿性氨基酸濃度進(jìn)行調(diào)整。針對銅綠假單胞菌對帕尼培南的體外藥敏檢測，宜采用低濃度氨基酸培養(yǎng)基進(jìn)行測定，這樣得到的結(jié)果更能符合人體內(nèi)實(shí)際情況。

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[8] Murmatsu H， Horii T， Morita M， et al. Effect of basic amino acids on susceptibility to carbapenems in clinical Pseudomonas aeruginosa isolates[J]. Int J Med Microbiol， 2003， 293（2-3）： 191-197.

[9] 蕭晨路， 韓立中， 孫景勇， 等. 鮑曼不動桿菌及銅綠假單胞菌體外抗菌活性的分析及培養(yǎng)基的影響[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2011， 26 （9）： 582-585.

（收稿日期：2013-12-12）