豬圓環(huán)病毒2型重組病毒分離株的鑒定

李海超，韓凌霞＊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus virus type 2，PCV-2）是廣泛分布于豬體內(nèi)的一種病原體，與多種病原混合感染導(dǎo)致發(fā)病，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CVAD）［1］。其主要癥狀之一的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］，臨床癥狀為消瘦、生長遲緩和淋巴結(jié)腫大［3］。其他臨床癥狀還包括豬皮炎和腎病綜合癥［4］、豬呼吸綜合征［5］和繁殖障礙［6］等。此外，PCV-2還與其他的疾病有關(guān)聯(lián)，例如滲出性皮炎［7］和仔豬先天性震顫［8］等。

PCV-2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是無囊膜、單鏈環(huán)形DNA 病毒，基因組大小約為1.7kb 左右［3］。由11個開放閱讀框（ORF）組成，其中ORF1編碼復(fù)制相關(guān)的蛋白Rep和Rep′［9］，ORF2編碼衣殼蛋白Cap［10］，ORF3編碼的蛋白可能參與誘導(dǎo)病毒的凋亡［11］。

通常根據(jù)ORF2基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析，將PCV-2 分 為PCV-2a、PCV-2b 和PCV-2c3個基因型，PCV-2a有5個亞型2A、2B、2C、2D 和2E，PCV-2b有3個亞型1A、1B和1C［12-13］。PCV-2a和PCV-2b與豬圓環(huán)病毒疾病密切相關(guān)，2005 年以前流行的PCV-2毒株主要是PCV-2a，2005 年以后PCV-2b則成為優(yōu)勢流行毒株，并引起了更為嚴(yán)重的豬圓環(huán)病毒疾病［14］。PCV-2c基因型，僅存在于丹麥并且與豬圓環(huán)病毒疾病無關(guān)。盡管不同PCV-2 分離株的致病性存在差異，但是通過對GenBank上公布的PCV-2全基因組序列分析顯示核酸序列同源性在93%以上［12］。雖然如此，點突變和重組仍可能是PCV-2進(jìn)化的重要因素，導(dǎo)致了病毒基因組的遺傳變異。Olvera等在2007年通過使用生物學(xué)軟件對公布的PCV-2全基因組序列進(jìn)行重組分析提出了PCV-2存在重組現(xiàn)象。也有一些田間試驗支持PCV-2重組理論［15-16］。此外，也有豬群混合感染不同基因型PCV-2 的報道，是重組事件發(fā)生的前提［17］。我國關(guān)于PCV-2田間分離株亞型之間發(fā)生自然重組的報道還很少。本研究對來自臨床疑似PMWS癥狀的豬病料進(jìn)行病毒分離鑒定及全基因組克隆與測序，目的在于分析PCV-2毒株之間的遺傳關(guān)系，為今后深入研究該病的分子生物學(xué)特性及開發(fā)有效疫苗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2013年采自黑龍江省某豬場臨床疑似PMWS患病豬的脾臟、肺臟、心臟和淋巴結(jié)等樣品共6份。病料勻漿后分裝在EP 管內(nèi)，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 LA-TaqDNA 聚合酶、pMD18-T 載體和DNA Marker DL 2 000均為寶生物（大連）工程有限公司產(chǎn)品；DNAzol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒總DNA 的提取 按照DNAzol Reagent提取試劑盒的說明書操作，首先取750μL DNAzol Reagent與250μL 組織勻漿液混勻，室溫靜止5min。4 ℃、12 000r／min離心10min。取上清加到一個新的EP管中，加500μL 無水乙醇室溫靜置5min，4 ℃、12 000r／min 離心10 min，棄上清。加1 mL 75 0 mL／L 乙醇，4 ℃、12 000r／min離心5min棄掉液體。用20μL無DNA 酶和RNA酶的焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解含有病毒核酸的總DNA 到中，置-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 參考GenBank上公布的PCV-2的序列（AF055394，屬PCV-2b基因型），使用OLIGO6和PRIMER 5.0軟件設(shè)計引物，P1和P2擴(kuò)增PCV-2ORF2部分基因，用于檢測樣品中的PCV-2，并且可區(qū)分PCV-1 和PCV-2；P3 和P4用來擴(kuò)增PCV-2全基因（表1）。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.2.3 PCR檢測 以提取的總DNA 為模板，利用引物P1和P2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃5min；94 ℃30s，60 ℃30 s，72 ℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。退火溫度按表1進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用10g／L 的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測。

1.2.4 PCV-2全基因組的擴(kuò)增與克隆 使用引物P3和P4從PCV-2核酸鑒定是陽性的病料中擴(kuò)增PCV-2全基因組，PCR 擴(kuò)增體系為50μL：LA-TaqDNA 聚合酶0.5μL，dNTP 8μL，10×LA buffer 5 μL，上、下游引物（1 0pmol／μL）各2μL 的，DNA模板2μL，加去離子水至50μL。PCR 程序為：95℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃70s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10min。在10g／L 瓊脂糖凝膠上電泳檢測PCR 產(chǎn)物。用膠回收試劑盒（Axygen公司）按照說明書回收目的產(chǎn)物。按照TaKaRa公司的pMD18-T 載體說明書，將目的片段與pMD18-T 載體按照適當(dāng)濃度的比例于16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG／X-Gal誘導(dǎo)后挑取白斑，通過菌液PCR鑒定，將正確的陽性質(zhì)粒送至華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.5 PCV-2 分離株序列及毒力的分析 利用MEGA5.03軟件和DNA Star軟件，從提交到Gen-Bank中的PCV-2 全基因序列中選取PCV-2a2A、PCV-2a2B、PCV-2a2C、PCV-2a2D、PCV-2a2E、PCV-2b1A、PCV-2b1B和PCV-2b1C八個亞型的參考毒株（每個亞型選取2 株，登錄號見圖1），利用DNA Star軟件中的MegAlign方法與1.2.4中的6株P(guān)CV-2全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，并確定基因亞型。同時根據(jù)宋勤葉等［18］的報道，根據(jù)ORF2 76位和131位點的氨基酸殘基初步分析PCV-2分離株的毒力。

1.2.6 PCV-2 分離株的重組分析 使用RDP4（recombination detection program，RDP）軟件中的RDP、GENECONV、BootScan、Maxchi、Chimaera、Siscan和3Seq算法對6株P(guān)CV-2分離株序列和參考序列進(jìn)行重組預(yù)測。用重組RDP4 軟件檢測PCV-2分離株是否存在重組位點，并確定可能的親本序列。重組檢測方法的常規(guī)設(shè)置為：window 大?。?0，P＝0.01 以及Bonferroni多重比較校正。最后用SIMPLOT 3.5.1軟件對RDP 軟件預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行驗證。

2 結(jié) 果

2.1 病料PCR檢測結(jié)果

本研究中采集的6 份病料均可以擴(kuò)出493bp大小的目的條帶（圖1）。

2.2 PCV-2全基因組的擴(kuò)增及測序

從PCV-2 核酸陽性的病料組織DNA 中經(jīng)PCR 擴(kuò)增出特異性的目的條帶，其大小與預(yù)期值相符合（圖2）。經(jīng)膠回收后將目的片段與pMD-18T載體相連，對篩選出的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示這6株分離株的基因組大小均為1 767 bp。Blast比對結(jié)果顯示這6株分離株與NCBI上提交的PCV-2全基因組的核苷酸同源性為94%～100%，而與PCV-1 全基因組核苷酸的同源性在75.6%～76.6%之間，表明分離到的6株分離株為PCV-2。

圖1 病料PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of samples

2.3 分離株與參考株的核酸序列的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析

MegAlign同源性比較結(jié)果表明，分離株與參考株的核酸序列同源性為94.5%～99.9%。6個分離株之間核酸同源性為94.6% ～99.9%。用MEGA5.03軟件中的N～J法系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，6株分離毒中LNF3、HEBF5 和HEN65 為PCV-2b1C，LN51為PCV-2b1B、HEN60 株 為PCV-2b1A，HEBF7 屬 于PCV-2a，但不屬于任何PCV-2a亞型（圖3）。

2.4 分離毒株的ORF2序列特征及毒力分析

通過MEGA5.03軟件分析，6株分離株的ORF1在氨基酸水平上高度保守。3 株P(guān)CV-2b1C亞型和1株P(guān)CV-2a型的ORF2長702bp，編碼的Cap蛋白為233 個氨基酸，另外2 個亞型毒株的ORF2長705bp，這個突變導(dǎo)致了1個氨基酸的延長，這與參考序列相符合。用DNA Star軟件對ORF2推導(dǎo)氨基酸同源性分析，分離株與參考株之間的氨基酸同源性為88.1%～99.6%，5 株P(guān)CV-2b型分離株之間的氨基酸的同源性為93.2%～99.6%；與PCV-2b 和PCV-2a亞型參考序列的氨基酸的同源性分別為93.2%～99.1%和87.7%～93.2%。而HEBF7的氨基酸與其他5株分離株的同源性為88.1%～90.6%，與PCV-2b和PCV-2a亞型的氨基酸同源性分別為90.1%～91.0%和92.8%～94.9%。LNF3、HEBF7、HEN65、LN51和HEN60的ORF2的76位點為I，131位點為T，根據(jù)PCV-2強(qiáng)、弱毒株氨基酸位點差異［17］，初步判定LNF3、HEBF7、HEN65、LN51 和HEN60 均為強(qiáng)毒。但是HEBF7在76位點為I，而131位點為P，根據(jù)上述的強(qiáng)、弱毒的判斷標(biāo)準(zhǔn)不能進(jìn)行判斷。

圖2 PCV-2分離株全基因組擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of PCV-2isolate genome

2.5 分離株的重組分析

用RDP4.2.4 軟件中的RDP、GENECONV、BootScan、Maxchi、Chimaera、Siscan和3Seq算法對本次分離到的6株P(guān)CV-2分離株和參考序列進(jìn)行重組預(yù)測，算法／P 值分別為RDP／9.646×10-5、GENECONV／7.832×10-3、BootScan／3.484×10-5、Maxchi／9.196×10-6、Chimaera／8.816×10-5、Siscan／5.405×10-4和3Seq／1.534×10-7僅僅檢測到LN51發(fā)生重組。與主要親本PCV-2b1A（GenBank登錄號DQ2207301株）和次要親本PCV-2a2A（GenBank登錄號AF117753）的比例概率超過99%，暗示可能是PCV-2a和PCV-2b基因型發(fā)生遺傳交換，預(yù)測其重組起始和終止位點分別為1 765nt和508nt（圖4）。

以DQ220730-PCV-2b1A 和AF117753-PCV-2a2A 為親本，用SIMPLOT 3.5.1軟件對LN51進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示與RDP 軟件分析的結(jié)果類似（圖4）。LN51在rep 基因區(qū)域與PCV-2a2A 在核酸水平上高度同源，與PCV-2b1A 在cap基因區(qū)域的核酸高度同源。Bootscan分析（圖5）表明交叉區(qū)域位于rep 基因區(qū)域內(nèi)，與RDP4.2.4軟件分析結(jié)果相似。

圖3 6株分離株與部分參考序列全基因組聚類分析Fig.3 The genome sequence cluster analysis of 6isolates and reference strains

圖4 重組序列的同源性分析Fig.4 Similarity analysis of recombinant sequences

3 討 論

PCV-2主要損傷免疫器官造成免疫抑制，是導(dǎo)致其他疾病混合感染的主要因素，因此對PCV-2的基因型、毒力和病毒重組等的鑒定能對PCV-2的致病機(jī)理和疫苗研制提供重要信息。有資料表明，PCV-2的突變率比任何DNA 病毒的突變率都高，與多數(shù)RNA 病毒的突變率相似，是導(dǎo)致不同基因型出現(xiàn)的原因之一［19］。目前公認(rèn)PCV-2 有PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c3個基因型，其中PCV-2a和PCV-2b分別有5 個（2A-2E）和3 個（1A-1C）亞型［20］。PCV-2a和PCV-2b是豬圓環(huán)相關(guān)疾病的主要病原體，也與本研究從現(xiàn)地病料中得到的PCV-2基因型相符（5株P(guān)CV-2b，1 株P(guān)CV-2a）。HEBF7與PCV-2a和PCV-2b亞型ORF2的氨基酸同源性均在90%以上，依據(jù)PCV-2強(qiáng)、弱毒株氨基酸位點差異原則，在ORF2的76位和131同時具有強(qiáng)毒和弱毒的特征，可能進(jìn)化上正處于PCV-2a向PCV-2b的過渡。

圖5 重組序列的Bootscan分析Fig.5 Analysis of recombinant sequences by Bootscan

重組對于病毒的進(jìn)化非常重要，是PCV-2遺傳多樣性產(chǎn)生的原因之一［12］。本研究分析結(jié)果表明LN51分離株可能是PCV-2b和PCV-2a基因型之間出現(xiàn)的重組，且2b1A 和2a2A 基因型毒株分別為主要親本和次要親本，與之前的研究相一致。事實上，根據(jù)Olvera A 等［12］的研究，這兩個基因亞型是最常見的PCV-2重組親本。

Ramos N 等［21-23］根據(jù)重組理論對GenBank 收錄的PCV-2序列進(jìn)行重組分析，認(rèn)為rep 基因區(qū)域是最佳重組區(qū)域—最佳重組起始位點在rep基因的5′端42nt～89nt，最佳結(jié)束位點位于rep 基因的389nt和429nt（對應(yīng)于rep′的轉(zhuǎn)錄剪切位點），也有自然條件下的重組證據(jù)。然而，也有很多試驗提出在ORF2區(qū)域各基因型之間和內(nèi)部也能出現(xiàn)重組現(xiàn)象［24］。本研究預(yù)測LN51 株是來自O(shè)RF1 基因1 765nt～508nt之間的重組，意味著PCV-2重組的區(qū)域可能更廣泛。另外，不同基因型PCV-2 在ORF1和ORF2 之間重組能顯著提高病毒復(fù)制能力，改變抗原表位［25］。

研究PCV-2 毒株間重組、重組發(fā)生的高頻區(qū)域，以及重組對于病毒抗原性和致病性的潛在影響，對于闡明PCV-2相關(guān)疾病的分子致病機(jī)理、生物學(xué)特性以及開發(fā)疫苗都有重要的指導(dǎo)意義。

［1］Opriessnig t，Meng X J，Halbur P G.Porcine circovirus type 2 associated disease：update on current terminology，clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies［J］.Vet Diagn Invest，2007，19（6）：591-615.

［2］Rose N，Opriessnig T，Grasland B，et al.Epidemiology and transmission of porcine circovirus type 2（PCV-2）［J］.Virus Res，2012，164（1-2）：78-89.

［3］Ge X，Wang F，Guo X，et al，Porcine circovirus type 2and its associated diseases in China［J］.Virus Res，2012，164（1-2）：100-106.

［4］Rosell C，Segalés J，Ramos Vara J，et al.Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome［J］.Vet Rec，2000，146（3）：40-43.

［5］湯 潔，虞飛龍.豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環(huán)病毒病混合感染的診斷與防治方法探析［J］.科學(xué)時代，2013，16（2）：82-85.

［6］West K H，Bystrom J M，Wojnarowicz C，et al.Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus 2［J］.J Vet Diagn Invest，1999，11（6）：530-532.

［7］Kim J，Chae C.Concurrent presence of porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus in retrospective cases of exudative epidermitis in pigs［J］.Vet J，2004，167（1）：104-106.

［8］Stevenson G W，Kiupel M，Mittal S K，et al.Tissue distribution and genetic typing of porcine circovirus in pigs with naturally occurring congenital tremors［J］.Vet Diagn Invest，2001，13（1）：57-62.

［9］Mankertz A，Hillenbrand B.Replication of porcine circovirus type 1requires two proteins encoded by the viral rep gene［J］.Virology，2001，279（2）：429-438.

［10］Nawagitgul P，Morozov I，Bolin S R，et al.Open reading frame 2of porcine circovirus type 2encodes a major capsid protein［J］.Gen Virol，2000，81（Pt 9）：2281-2287.

［11］Liu J，Chen I，Kwang J.Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus induced apoptosis.［J］.Virology，2005，79（13）：8262-8274.

［12］Olvera A，Cortey M，Segalés J.Molecular evolution of porcine circovirus type 2genomes：phylogeny and clonality［J］.Virology，2007，357（2）：175-185.

［13］Segalés J，Olvera A，Grau-Roma L，et al.PCV-2genotype definition and nomenclature［J］.Vet Rec，2008，162（26）：867-868.

［14］Wiederkehr D D，Sydler T，Buergi E，et al.A new emerging genotype subgroup within PCV-2b dominates the PMWS epizooty in Switzerland［J］.Vet Microbiol，2009，136（1-2）：27-35.

［15］Cadar D，Cságola A，Lorincz M，et al.Detection of natural in-ter-and intra-genotype recombination events revealed by cap gene analysis and decreasing prevalence of PCV-2in wild boars［J］.Infect Genet Evol，2012，12：420-427.

［16］Ca L，Ni J，Xia Y，et al.Identification of an emerging recombinant cluster in porcine circovirus type 2［J］.Virus Res，2012，165：95-102.

［17］Zhai S L，Chen S N，Wei Z Z.et al.Co-existence of multiple strains of porcine circovirus type 2in the same pig from China［J］.Virol J，2011，13（8）：517.

［18］宋勤葉，馬增軍，李潭清.豬圓環(huán)病毒2型河北分離株的基因型鑒定及其毒力分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44（9）：6-9.

［19］Duffy S，Shackelton L A，Holme E C.Rates of evolutionary change in viruses：patterns and determinants［J］.Nat Rev Genet，2008，9（4）：267-276.

［20］Segals J，Olvera A.PCV-2genotype definition and nomenclature［J］.Vet Rec，2008，162（26）：867-868.

［21］Ramos N，Mirazo S，Castro G，et al.Molecular analysis of porcine circovirus Type 2strains from Uruguay：evidence for natural occurringrecombination［J］.Infect Genet Evol，2013，19：23-31.

［22］Kim H K，Luo Y，Moon H J，et al.Phylogenetic and recombination analysis of genomic sequences of PCV-2isolated in Korea［J］.Virus Genes，2009，39（3）：352-358.

［23］Ma C M，Hon C C，Lam T Y，et al.Evidence for recombination in natural populations of porcine circovirus type 2in Hong Kong and mainland China［J］.J Gen Virol，2007，88（t6）：1733-1737.

［24］Cai L，Ni J，Xia Y，et al.Identification of an emerging recombinant cluster in porcine circovirus type 2［J］.Virus Res，2012，165（1）：95-102.

［25］Guo L J，Lu Y H，Huang L P，et al.First construction of infectious clone for newly emerging mutation porcine circovirus type 2 （PCV-2）followed by comparison with PCV-2aand PCV-2bgenotypes in biological characteristics in vitro［J］.Virology，2011，419：57-63.