駑巴貝斯蟲二溫式PCR檢測方法的建立及初步應用

張 楊，達伊力特，劉 進，李 佳，巴音查汗＊

（1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊，830052；2.新疆和靜縣畜牧獸醫(yī)站，新疆和靜841300；3.新疆和靜縣巴音布魯克鎮(zhèn)獸醫(yī)站，新疆和靜841300）

駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）是經(jīng)由蜱傳播，寄生于馬、驢、騾、斑馬等馬屬動物紅細胞內的一種血液原蟲［1-2］。牲畜感染駑巴貝斯蟲后多出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸、食欲不振、厭食、消瘦等癥狀，急性病例會發(fā)生死亡［3-4］。該病呈世界性分布，在美洲、非洲、亞洲、歐洲、大洋洲均有駑巴貝斯蟲病的相關報道［5-6］。近年來，駑巴貝斯蟲病呈逐漸上升趨勢，給該病的防控帶來了嚴峻的考驗［7］。目前，駑巴貝斯蟲的檢測手段主要有臨床診斷、血液涂片鏡檢、免疫學診斷方法和分子生物學方法［8］等。我們課題組前期試驗研究，曾赴巴音布魯克焉耆馬場和昭蘇馬場進行了有關馬常見寄生蟲的流行病學調查，發(fā)現(xiàn)馬蜱傳梨形蟲病和消化道寄生蟲較普遍感染馬匹，且前者的急性病例若不及時診治，常會導致患馬死亡的現(xiàn)象。傳統(tǒng)的血液涂片鏡檢方法雖然方便、直觀，但檢測的準確性遠遠達不到要求。PCR 方法［9］是一種敏感、特異、快速的診斷方法，二溫式PCR 較常規(guī)PCR 方法而言，具有省時、減少非特異性擴增等特點［10］。本研究根據(jù)馬駑巴貝斯蟲棒狀蛋白Bc-48基因［11］的穩(wěn)定區(qū)設計了一對特異性引物，建立了一種快速檢測駑巴貝斯蟲的二溫式PCR 方法，經(jīng)初步用于臨床樣品的檢測，表明具有一定的臨床使用價值，可為今后駑巴貝斯蟲病的早期診斷提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性蟲種 駑巴貝斯蟲（B.caballi）、馬泰勒蟲（Theileria equi）、雙芽巴貝斯蟲（B.bigemina）、環(huán)形泰勒蟲（T.annulata）、瑟氏泰勒蟲（T.sergenti）等陽性DNA 由新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院實驗室保存。

1.1.2 臨床樣品 臨床樣品采自和靜縣巴音布魯克地區(qū)（焉耆馬匹的分布區(qū)域）疑似感染駑巴貝斯蟲的抗凝全血，共82份。

1.1.3 試劑 全血基因組提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；pEASY-T1 載體購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR 試劑（TaqDNA 聚合酶、MgCl2、dNTPs、10×PCR buffer（Mg2＋free））、DNA Marker DL 2 000、限制性核酸內切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；其余化學試劑均為國產分析純試劑。

1.1.4 儀器設備 紫外分光光度計（nanodrop 2000c）為Thermo公司產品；梯度PCR 儀（Professional Thermocycler）為Biometra公司產品；凝膠成像系統(tǒng)（G：BOX）為Syngene為公司產品；恒溫搖床（TS-2102C）為天呈公司產品；離心機（SIGMA 1-14）為SIGMA 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 設計引物 根據(jù)GenBank 中駑巴貝斯蟲Bc-48基因序列（登錄號：AB731211）保守區(qū)，應用Primer Premier 5.0和Oligo6.0軟件設計了一對特異性引物，Bc48-F：5′-CGCATTTGCAGTCAGGTC-3′，Bc48-R：5′-TGGTAGGGCTCAGGAAGG-3′；由北京鼎國生物技術公司合成。

1.2.2 基因組DNA的提取 按照全血基因組提取試劑盒說明書提取被檢馬匹全血DNA，置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 反應體系及反應條件的篩選 以提取的駑巴貝斯蟲DNA 為模板，PCR反應條件：94℃3min；94℃15s，55℃45s，30個循環(huán)；最后72℃3 min。退火延伸溫度梯度為53℃～62℃，退火延伸時間梯度為15s、30s、45s、1min。

1.2.4 重組質粒及序列比對 將確定的陽性DNA進行PCR 試驗，PCR 產物使用膠回收試劑盒回收和純化，將回收、純化后的PCR 產物與pEASY-T1載體連接，轉化至感受態(tài)細胞E.coliDH5α中，將其置于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落接種于含氨芐青霉素LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取陽性質粒進行PCR鑒定，并送至北京鼎國生物技術公司進行測序分析。

1.2.5 敏感性試驗 對提取的駑巴貝斯蟲陽性DNA 用紫外分光光度計測定OD260nm 值，計算DNA 的濃度（原始濃度為228ng／μL），對該模板進行10倍倍比稀釋至10-9，采用優(yōu)化后的最佳反應條件進行二溫式PCR 擴增，測定最低模板檢測量。

1.2.6 特異性試驗 分別以駑巴貝斯蟲、馬泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲的DNA 為模板，雙蒸水為空白對照，進行特異性試驗。

1.2.7 臨床應用 應用建立的二溫式PCR 方法對82份臨床樣品進行檢測，同時進行血涂片鏡檢，對比二者的臨床利用情況。

2 結果

2.1 PCR反應體系及退火-延伸溫度和時間的篩選

應用均勻設計方法對二溫式PCR 優(yōu)化最佳反應體 系 為：反 應 體 系（25 μL）：10×PCR buffer（Mg2＋free）3μL，MgCl2（25 mmol）2μL，dNTPs（2.5mmol）2μL，上下游引物（10μL）1μL，TaqDNA 聚合酶（5U／μL）0.2μL，模板DNA 2μL，滅菌雙蒸水補足至25μL。優(yōu)化反應條件：94℃3 min；94℃15s，55℃45s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min（圖1）。7號泳道的PCR 產物條帶最亮，因此將7 號泳道的體系設為最優(yōu)反應體系。PCR 產物進行12g／L 瓊脂糖凝膠電泳，擴增出條帶大小為155bp的電泳條帶，與預期設計的目的片段大小相符（圖2）。

2.2 重組質粒鑒定及重組序列的比對結果

將小量提取的DNA 進行二溫式PCR 試驗，得到與目的片段大小相同的大小約為155bp特異性條帶（圖3），說明重組質粒提取成功且重組質粒對建立的PCR 方法敏感。將鑒定為陽性的重組質粒送至北京鼎國生物技術公司測序，測序結果得到的目的基因與引物設計時所選片段（GenBank序列號：AB731211）的同源性為98%（圖4）。

圖1 PCR反應體系及循環(huán)條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the reaction system and circulation condition of PCR

圖2 PCR 產物的電泳分析Fig.2 Electrophoretic analysis of PCR products

圖3 重組質粒PCR鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant plasmid

圖4 PCR 擴增產物序列比對結果Fig.4 Sequence alignment result of PCR amplification products

2.3 敏感性試驗結果

對該模板以10倍梯度進行倍比稀釋，采用優(yōu)化好的反應條件進行PCR 擴增，結果顯示當模板DNA（228ng／μL）倍比稀釋至10-8時，PCR 擴增時無條帶出現(xiàn)，即該二溫式PCR 最低能檢測出的樣品拷貝數(shù)為5.17×102copies／μL（圖5）。如圖5 所示，第1泳道至第9泳道都有條帶，條帶在155bp左右，與目的條帶大小相符，第1泳道至第9泳道，條帶亮度依次減弱，條帶寬度依次變窄，說明隨著模板DNA 濃度依次降低，條帶的亮度依次減弱。

圖5 PCR 敏感性試驗結果Fig.5 The results of PCR sensitivity experiment

2.4 特異性試驗結果

以駑巴貝斯蟲、馬泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲的DNA 為模板，按照最佳反應條件進行PCR反應后，結果駑巴貝斯蟲有特異性條帶，其他蟲種均無條帶，說明建立的方法對駑巴貝斯蟲具有良好的特異性（圖6）。1號泳道出現(xiàn)特異性條帶，條帶大小約為155bp左右，與目的片段相符。條帶清晰無二聚體和非特異性擴增，而其他含有馬泰勒蟲等DNA 的泳道無PCR 產物出現(xiàn)。

圖6 PCR 特異性試驗結果Fig.6 The results of PCR specificity experiment

2.5 臨床應用結果

對采集于新疆駑巴貝斯蟲高發(fā)地區(qū)的82份全血樣品進行了血液涂片鏡檢和二溫式PCR檢測。該區(qū)樣品血液涂片檢測結果陽性率為37.80%（31／82），經(jīng)二溫式PCR檢測后陽性率為69.51%（57／82），其中血液涂片檢測為陽性的樣品經(jīng)二溫式PCR檢測均為陽性，因此該二溫式PCR檢測方法在臨床應用上相較血液涂片鏡檢的檢出率更高效。

3 討論

本試驗所建立的二溫式PCR檢測方法是利用較短的DNA 片段，將退火和延伸合并為一步，使二溫式PCR 可以和普通三溫式PCR 一樣擴增出相當數(shù)量的產物［12］。當退火和延伸結合為一步后，更容易保證產物的特異性，更適合于大規(guī)模群體監(jiān)測高通量檢測，同時避免了常規(guī)的三溫式PCR檢測方法需要經(jīng)歷變性、退火、延伸三步反應繁瑣、耗時［13］的缺點，可用于馬梨形蟲感染早期的診斷。

在建立二溫式PCR 方法時，本試驗對影響PCR 的幾種因素采取了均勻設計的方法篩選優(yōu)化反應體系［14］，最終選取了最優(yōu)的體系。本試驗特異性地擴增出了大小為155bp條帶，與設計的引物條帶大小相符，亦與馬駑巴貝斯蟲陽性DNA 條帶一致，而其他梨形蟲陽性DNA 未出現(xiàn)條帶。對二溫式PCR 方法獲得的駑巴貝斯蟲陽性DNA（初始濃度為228ng／μL）進行了倍比稀釋至5.17×102copies／μL，發(fā)現(xiàn)仍可通過PCR檢測到陽性DNA（155 bp），說明該方法最低可檢5.17×102copies／μL 拷貝數(shù)的樣品。

本試驗以馬駑巴貝斯蟲棒狀蛋白Bc-48基因序列為模板設計了的特異性引物，該蛋白目前被認定專門應用于蟲種鑒別上的特異性蛋白，且所建立的二溫式PCR 方法在臨床應用中具有快速、敏感、高效等特點［15］。本試驗在應用所建立的方法來檢測樣品（采自于巴音布魯克區(qū)域的焉耆馬樣品共82頭份）時，將血液涂片結果和二溫式PCR檢測結果進行了對比，發(fā)現(xiàn)血液涂片對檢測小樣本確實具有直觀、高效等優(yōu)點，但檢測大量臨床樣本時，稍顯耗時、低效，而二溫式PCR 方法較快速、靈敏、準確，同時較常規(guī)PCR 診斷方法也省時省力，為馬駑巴貝斯蟲病的臨床診斷和流行病學調查提供了技術手段。

［1］Brüning A，Phipps P，Posnett E，et al.Monoclonal antibodies againstBabesia equiand their application in serodiagnosis［J］.Vet Parasitol，1997，58（1／2）：11-26.

［2］Santiago V，Rosana D.Study of the serological prevalence ofTheileria equiandBabesia caballiin pure spanish breed horses in the valencian community［J］.Vet Med，2012，69（1-2）：1-6.

［3］Avarzed A，Igarashi I，Kanemaru T，et al.Improvedin vitrocultivation ofBabesia caballi［J］.J Vet Med Sci，1997，59（6）：479-481.

［4］羅 金，劉光遠，謝俊仁，等.駑巴貝斯蟲病PCR檢測方法的建立和應用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，38（7）：193-195.

［5］Bhoora R，Quan M，Paul T，et al.Sequence heterogeneity in the equi merozoite antigen gene（ema-1）ofTheileria equiand development of an ema-1-specificTaqMan MGBTM assay for the detection ofT.equi［J］.Vet Parasitol，2010，172（27）：33-45.

［6］羅 金，劉光遠，田占成，等.馬梨形蟲病診斷技術研究現(xiàn)狀［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（1）：99-102.

［7］Hiromi I，Xuan X N，Ikuo I，et al.Cloning and expression of a 48-kilodaltonBabesia caballimerozoite rhoptry protein and poten-tial use of the recombinant antigen in an enzyme-linked im-mun-osorbent assay［［J］.J Clin Microbiol，1999，37（11）：3475-3480.

［8］Li Y J.Detection ofTheileriaandBabesiasp.in Ixodid ticks from Qinghai province，northwestern China［J］.J Animal Vet Adv，2013，12（6）：775-778.

［9］Tavares R G，Staggemeier R，Borges A L P，et al.Molecular techniques for the study and diagnosis of parasite infection［J］.J Venom Anim Toxin Includ Trop Dis，2011，17（3）：239-248.

［10］Wu J B.Fast detection of genetic information by an optimized PCR［J］.Biomed Microd，2012，14：179-186.

［11］薛書江，于龍政，曹世諾，等.駑巴貝蟲BC-48基因的克隆及其在大腸埃希菌中的表達［J］.中國獸醫(yī)科學，2007，37（3）：214-217.

［12］董 倩，黃國強，葉冰瑩，等.二溫式PCR 在特異短核酸探針合成中的應用［J］.花生學報，2008，37（3）：5-10.

［13］閻小君，蘇成芝，吉昌華.一種快速微量的雙溫PCR 法［J］.生物化學與生物物理進展，1991，19（6）：480-481.

［14］朱 濱，王囯荃，陳 堅.用均勻設計優(yōu)化apo E 基因的PCR 擴增方案［J］.生物化學與生物物理進展，2000，27（3）：311-315.

［15］王振寶，劉啟生，哈 森，等.牛環(huán)形泰勒蟲病二溫式PCR 診斷方法的建立及初步應用［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33（5）：59-63.