苦馬豆生物堿成分薄層色譜分析

白瑪桑姆，楊曉雯，馬 烽，周啟武，劉曉學，王 磊，趙寶玉＊

（1.西北農(nóng)林科技大學，陜西楊凌712100；2.臨滄師范高等專科學校，云南臨滄677000）

苦馬豆（Swainsona salsula）在青海俗稱尿泡草或苦豆子，蒙名洪呼圖額布斯，別名羊尿泡、馬尿泡、羊卵蛋、紅花苦豆子等，是豆科苦馬豆屬（Sphaerophysa）多年生草本植物。全世界有3種，分布于亞洲，我國僅有有1 種，廣泛分布在內(nèi)蒙古、河北、吉林、遼寧、山西、陜西、寧夏、甘肅、青海、新疆等地?？囫R豆為耐鹽堿、耐貧瘠、耐干旱植物，多生長于海拔960m～3 180 m 的山坡、草原、荒地、荒漠沙質(zhì)地、沙灘、戈壁、溝渠旁及鹽池周圍［1］。青海省海西州都蘭縣1992年-1998 年間發(fā)生大量綿羊苦馬豆中毒，共造成2 300余只羊死亡，給當?shù)匦竽翗I(yè)造成較大經(jīng)濟損失。也有資料報道，苦馬豆作為豆科植物，營養(yǎng)價值豐富，粗蛋白為15%左右，與苜蓿相當，具有潛在的飼用價值，是一種可利用的植物資源［2］。中醫(yī)記載，苦馬豆味微苦、性平，入藥有利尿、止血、消腫等功效，民間用于主治肝硬化腹水、血管神經(jīng)性水腫、慢性肝炎浮腫等癥［3］（《中華本草》1999），具有重要的醫(yī)學研究和應(yīng)用價值。目前，國內(nèi)對苦馬豆的研究主要集中在化學成分方面，已從苦馬豆中分離出黃酮醇類、異黃酮類、異環(huán)烷類、木脂素類、酚酸類、三萜類及甾醇類等成分［4-5］，但其生物堿類成分，特別是毒性成分研究較少。據(jù)報道，澳大利亞灰苦馬豆（Swainsona canescens）中含有吲哚里西啶生物堿苦馬豆素［6］，并確認是導致動物苦馬豆中毒的主要毒性成分［7］。王凱［8］對我國青海省引起牲畜中毒的苦馬豆生物堿進行了薄層色譜分析，初步認為其含有苦馬豆素，但未從苦馬豆中分離純化出苦馬豆素單體成分；趙清梅等［9］對苦馬豆生物堿成分研究認為，寧夏采集的苦馬豆中含有苦參堿，但不含苦馬豆素或所含苦馬豆素低于檢測限。本試驗擬通過對苦馬豆生物堿成分系統(tǒng)提取、薄層色譜分析和柱層法分離，初步搞清楚苦馬豆所含生物堿的種類，確證苦馬豆是否含有苦馬豆素，為明確苦馬豆的毒性成分提供理論依據(jù)。同時也可為苦馬豆生物堿化學成分生物活性研究及其植物資源綜合利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣品 苦馬豆地上部分全草2012年7月采集于甘肅武威（37°55′40.47″N；102°38′10.95″E），自然風干后，粉碎，過20目篩，送回實驗室置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆?。植物樣品由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院常朝陽研究員鑒定。

1.1.2 主要試劑與儀器 氯仿、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、甲醇、乙醇、氨水（分析純），天津博迪化工有限公司產(chǎn)品；羧甲基纖維素鈉、薄層層析用硅膠GF52（化學純），青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；苦馬豆素標準品，西北農(nóng)林科技大學生物毒素與分子毒理實驗室提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；可調(diào)式電熱板，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；手提紫外分析儀，上海驥輝科學分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 苦馬豆生物堿系統(tǒng)提取 苦馬豆地上部分干草粉5kg，分批次置于圓底燒瓶中，加入適量工業(yè)酒精回流提取4h，過濾收集提取液，如此重復(fù)提取6次，合并提取液，減壓回收溶劑得總浸膏［9］?？偨嘟?jīng)酸化、堿化處理后，依次用氯仿和正丁醇分段萃取，得到各部位生物堿提取物。準確稱取浸膏重量，計算出膏率。

1.2.2 苦馬豆生物堿各萃取部分薄層色譜分析取苦馬豆酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇萃取部分浸膏少許，甲醇溶解，用毛細管點樣于自制硅膠GF254薄層板，置層析缸中上行法展開，待展開劑距薄層板上緣0.5cm 處取出，揮干展開劑。先在紫外光下（254nm 或365nm）觀察熒光，然后分別用改良碘化鉍鉀試劑和Ehrlich′s試劑顯色，記錄各斑點顏色并計算Rf值。

1.2.3 苦馬豆生物堿各萃取部分相對含量分析選取展開效果較好的薄層色譜板，均勻噴灑改良碘化鉍鉀顯色，用華南農(nóng)業(yè)大學提供的平面色譜圖像定量分析軟件（Image Quan 11）進行分析，測量各萃取部分生物堿顯色斑點的相對含量。每個斑點所顯現(xiàn)的峰面積除以總峰面積就是與其相對應(yīng)的生物堿斑點在各萃取部位的相對含量。如薄層板上出現(xiàn)n個清晰斑點，各斑點峰面積分別為S1、S2...Sn，每個斑點所代表的生物堿相對百分含量為X1、X2…Xn。通過下列公式計算苦馬豆生物堿各萃取部分所含生物堿成分的相對百分含量。

1.2.4 苦馬豆生物堿硅膠柱層析分離與純化 稱取堿性正丁醇萃取部分浸膏適量，與柱層析用硅膠1∶1重量比拌樣，干法上樣于預(yù)先裝好的硅膠層析柱，靜置30 min～1h，用氯仿∶甲醇∶氨水∶水（70∶26∶2∶2）體積比的洗脫劑洗脫，每50mL 收集1份，連續(xù)洗脫若干份，薄層色譜檢測，相同相近部分合并。

2 結(jié)果

2.1 苦馬豆生物堿提取結(jié)果

5kg苦馬豆干草粉經(jīng)工業(yè)酒精提取得到總浸膏650.2g，出膏率為13%。取200g醇浸膏酸化和堿化處理，氯仿和正丁醇萃取，分別得到酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇萃取部分浸膏3.01g、0.53g和23.13g，出膏率分別為和1.51%、0.27%和11.57%。

2.2 苦馬豆生物堿各萃取部分薄層色譜分析結(jié)果

2.2.1 酸性氯仿萃取部分薄層色譜分析結(jié)果 經(jīng)不同極性展開劑展開，在紫外光下觀察熒光后，分別用改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s 試劑顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在紫外光下可看到顯色斑點，而改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s試劑顯色無明顯斑點，表明酸性氯仿萃取部分生物堿種類很少。

2.2.2 堿性氯仿萃取部分薄層色譜分析結(jié)果 經(jīng)不同極性展開劑展開，在紫外光下觀察熒光后，分別用改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s 試劑顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在紫外光下觀察顯色成線條狀，無明顯斑點，而改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s試劑顯色均出現(xiàn)明顯斑點，結(jié)果可見，9種不同極性展開劑展開，以氯仿：甲醇＝3∶1；氯仿∶丙酮＝5∶1；氯仿：丙酮＝2∶1；氯仿∶丙酮＝1∶1；乙酸乙酯∶氨水＝20∶1；丙酮∶氨水＝20∶1；甲醇∶氨水＝20∶1，乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝10∶5∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝10∶10∶1體積比展開體系效果好，改良碘化鉍鉀顯色得到5個斑點?？梢娐确隆帽?∶1斑點Rf值及顏色為0.05（橘紅色），0.09（淺橘紅色），0.15（淺橘紅色），0.32（橘紅色），0.45（橘紅色）；由Ehrlich′s試劑可見，8種不同極性展開劑展開，以氯仿∶甲醇＝10∶1；氯仿∶甲醇＝3∶1；氯仿∶丙酮＝5∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶10∶1；乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝15∶10∶1；乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝10∶30∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝10∶10∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝5∶6.25∶1 乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝15∶30∶1 體積比展開體系效果好，顯色得到5個斑點Rf值及顏色0.05（淡紫色），0.11（淡紫色），0.31（淡紫色），0.50（淡紫色），0.69（紫色）。

2.2.3 堿性正丁醇萃取部分薄層色譜分析結(jié)果經(jīng)不同極性展開劑展開，在紫外光下觀察熒光后，分別用改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s 試劑顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在紫外光下觀察無明顯斑點，而改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s試劑顯色均出現(xiàn)顯色斑點，結(jié)果可見，以甲醇∶氨水＝20∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶10∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶15∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝30∶15∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝10∶10∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝4∶6∶1；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝4∶8∶1。由可見7種不同極性展開劑展開，正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶15∶1體積比展開體系效果好，改良碘化鉍鉀顯色得到4個斑點Rf值及顏色0.05（淺橘紅色），0.16（淺橘紅色），0.23（淺橘紅色）0.31（淺橘紅色）。由Ehrlich′s試劑顯色可見，4種不同極性展開劑展開，以正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶10∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝10∶15∶1；正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝30∶15∶1，；乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝5∶6.25∶1。以正丁醇∶乙酸乙酯∶氨水＝30∶15∶1體積比展開體系效果好，顯色得到6 個斑點Rf值及顏色0.09（紫色），0.23（淡紫色），0.34（淡紫色），0.42（淡紫色），0.55（淡紫色），0.63（淡紫色）。

2.3 苦馬豆堿性氯仿萃取部分生物堿相對含量測定結(jié)果

從以上薄層色譜顯色結(jié)果可以看出，苦馬豆酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇萃取部分用改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s試劑顯色，酸性氯仿萃取部分無明顯顯色斑點，堿性氯仿萃取部分顯色斑點明顯，而堿性正丁醇萃取部分雖然顯色，但成點性差。因此，本試驗僅對堿性氯仿萃取部分生物堿成分相對含量進行測定。乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水＝10∶5∶1體積比展開，改良碘化鉍鉀顯色有5個斑點，每個斑點相對含量結(jié)果見表1?？梢姲唿c⑤相對含量最高為36.24%，可能是苦馬豆堿性氯仿萃取部分中主要生物堿成分。

2.4 苦馬豆堿性正丁醇萃取部分柱層析分離結(jié)果

堿性正丁醇萃取部分硅膠柱層析分離，氯仿∶甲醇∶氨水∶水（70∶26∶2∶2）體積比的洗脫劑洗脫，共收集60份洗脫液，經(jīng)薄層色譜檢測，合并為5部分，1～5 組份改良碘化鉍鉀顯出1 個橘紅色斑點；6～15組份改良碘化鉍鉀顯出4個橘紅色斑點；16～25組份Ehrlich′s試劑顯出2淡紫色斑點；26～40組份Ehrlich′s試劑顯出1紫色斑點，與苦馬豆素標準品對照，斑點Rf值一致；41～60組份改良碘化鉍鉀和Ehrlich′s試劑不顯色。

表1 堿性氯仿部分生物堿相對百分含量的測定結(jié)果Table 1 The determination results of the relative contents of the part of alkaline chloroform alkaloids

3 討論

生物堿主要是存在于植物中的一類含氮有機化合物，大多數(shù)有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮素多包含在環(huán)內(nèi)，具有堿性和顯著的生物活性，往往是植物中重要的有效成分或毒性成分。目前科學家也從海洋生物、微生物及昆蟲的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)許多有機含氮化合物。生物堿種類很多，已經(jīng)明確結(jié)構(gòu)的國內(nèi)外約在10 000種左右，按其化學結(jié)構(gòu)可分吡咯烷類、吡啶類、異喹啉類、吲哚類、莨菪烷類、咪唑類、喹唑酮類、甾體類、二萜類、有機胺類等60 多種類型。按照極性可分為強極性、中等級性和弱極性三類［10］。本試驗根據(jù)生物堿極性強弱，按照系統(tǒng)提取原理，對苦馬豆地上部分生物堿進行系統(tǒng)提取，采用不同極性溶劑分為酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇三部分。結(jié)果200g苦馬豆醇浸膏經(jīng)酸化和堿化處理，氯仿和正丁醇萃取得到酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇萃取部分3.01g、0.53g和23.13 g，出膏率分別為1.51%、0.27%和11.57%，從出膏率可以看出，苦馬豆生物堿主要集中在堿性正丁醇萃取部分，屬大極性生物堿。薄層色譜分析發(fā)現(xiàn)，堿性氯仿和堿性正丁醇萃取部分用經(jīng)典改良碘化鉍鉀顯色，出現(xiàn)4～5 個顯色斑點，且成點性好，表明最少有4種生物堿成分，而用特異性Ehrlich′s顯色，出現(xiàn)5～6個顯色斑點，表明最少有5種生物堿成分且可能為吲哚里西啶類生物堿。堿性正丁醇萃取部分通過硅膠柱層析分離純化，洗脫組份經(jīng)與苦馬豆素標準品對照，發(fā)現(xiàn)含有苦馬豆素，確證了苦馬豆中苦馬豆素的存在，只是與富含苦馬豆素的瘋草類有毒植物相比，可能含量低，一般薄層檢測不明顯，但通過柱層析富集后相對含量增高，再用薄層檢測就十分明顯。

苦馬豆素是最早從澳大利亞灰苦馬豆（Swainsona canescens）中分離出的吲哚里西啶類生物堿，因植物而得名，隨后，陸續(xù)從斑莢黃芪、蘭伯氏棘豆、絹毛棘豆、甘肅棘豆、小花棘豆、冰川棘豆、變異黃芪等多種瘋草類有毒植物中分離得到，并被證明是瘋草類有毒植物引起動物中毒的主要毒性成分［11］。它是一種α-甘露糖苷酶特異性競爭性抑制劑，能抑制蛋白質(zhì)的糖基化過程，導致腫瘤細胞表面糖蛋白表達異常，抑制腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移，而具有良好的抗腫瘤作用。同時，苦馬豆素還能刺激機體的免疫系統(tǒng)，促進免疫細胞增生，增強NK細胞殺滅腫瘤細胞的能力［12］。苦馬豆素抗腫瘤活性和免疫增強作用，已引起國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，并作為抗腫瘤藥篩選的后備藥，這為苦馬豆作為潛在的藥源植物利用提供了理論依據(jù)。

苦馬豆廣泛分布于我國西部干旱、鹽堿化天然草地，雖然是一種有毒植物，放牧動物采食后可發(fā)生中毒，但作為豆科植物，又具有營養(yǎng)豐富的特點，如能避開其有毒的生物學特性，在苦馬豆生長繁茂地區(qū)可作為一種高蛋白牧草資源開發(fā)利用。

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