黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度組合的優(yōu)化＊

黃玉蘭，殷奎德，岳才軍

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

黃瓜屬葫蘆科黃瓜屬植物，其鮮果脆嫩多汁，營養(yǎng)豐富，清香可口，深受人們喜愛［1］?？傸S酮類化合物作為一種功能成分，具有許多有益的生理效應與藥理作用，越來越引起人們的重視［2-5］，隨著人們對總黃酮類物質的生物效能的逐步認識，對黃酮類化合物的研究也日益增多，有研究表明黃瓜葉中含有豐富的黃酮類物質［6］，而直接從黃瓜葉中提取總黃酮，不但耗費植物材料，而且生產周期長。在培養(yǎng)的植物細胞、組織中，大部分次生代謝產物的含量超過了野生植物的含量，因此以黃瓜培養(yǎng)細胞為材料提取該物質就成為一條重要的途徑，黃瓜培養(yǎng)細胞有兩種，一種是以固體培養(yǎng)的愈傷組織細胞，一種是以液體進行的懸浮培養(yǎng)細胞［7］。懸浮細胞可不斷增值，生長速度快，更有利于次級代謝產物的提取，而懸浮細胞體系建立的重要前提是愈傷組織的誘導。

本試驗以黃瓜無菌苗不同外植體為材料進行愈傷組織的誘導，采用響應面設計分析方法對黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)基中激素濃度組合進行優(yōu)化，篩選出最佳的激素配比，為黃瓜進一步懸浮細胞培養(yǎng)及生產次生代謝物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜津研4號由黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院提供。

1.2 方法

1.2.1 消毒方法 將黃瓜種子用清水洗凈，在超凈工作臺中用 0.1%升汞溶液浸泡10 min，75%乙醇浸30-60 s，無菌水沖洗5次后，備用。

1.2.2 初代愈傷組織的獲得 將消毒好的黃瓜種子接種于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中，進行暗培養(yǎng)，制備無菌苗。將5-7 d無菌苗子葉葉片切成0.5 cm ×0.5 cm 的小塊;胚軸和胚根切成 0.3-0.5 cm的小段，用長柄鑷子將切好的外植體接種到誘導培養(yǎng)基上 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA中，注意外植體的切口處向下(接觸培養(yǎng)基表面)。然后再以封口膜將三角錐瓶封上。將接種的培養(yǎng)瓶放入組織培養(yǎng)室的光照架上進行愈傷組織誘導，獲得初代愈傷組織，愈傷組織誘導率 =接種后第20 d產生愈傷組織的外植體個數/接種外植體總數×100%。同時篩選出誘導初代愈傷組織的最佳外植體。

1.2.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)激素配比設計 邱超等研究表明，6-BA是黃瓜組織培養(yǎng)中誘導愈傷組織形成必不可少的植物生長調節(jié)劑［8］，并根據一些文獻報道［9-10］，選擇組織培養(yǎng)中常用的三種激素6-BA，IAA，AgN03為試驗因素，考察各因素不同水平下對愈傷組織凈增鮮重的影響，選擇最佳的單因素激素條件。在單因素實驗的基礎上進行響應面設計，結果如表1，共20個組合，設計安排試驗(表2)。

1.2.4 最佳培養(yǎng)基的篩選 將培養(yǎng)15 d的初代愈傷組織切成大小平均為0.3 g的小塊，接入表2設計的不同培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，每個處理接種5瓶，每瓶4塊，每個處理共20塊，總質量為 6 g，即初始鮮重為6 g。接種15 d以后，再以初始鮮重的方法進行稱重即為最終鮮重，(最終鮮重－初始鮮重)即凈增鮮重為指標，進行最佳培養(yǎng)基的篩選。

1.2.5 數據分析 在不同因素試驗的基礎上，以6-BA，IAA，AgN03為考察變量，以凈增鮮重為響應值，應用Design-Expert7.1軟件，優(yōu)化黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度的組合。

2 結果與分析

2.1 不同外植體愈傷組織誘導情況

表1為不同外植體愈傷組織誘導情況。從表1可見，子葉和下胚軸均有較高的愈傷組織誘導率，而胚根和真葉的愈傷組織誘導情況不理想，胚根誘導的愈傷組織有褐化現(xiàn)象，真葉的誘導率較低，誘導率只是子葉和下胚軸的一半。下胚軸與子葉相比，誘導的愈傷組織的數量相差不多，但愈傷組織呈水漬狀，質量較差，不適合繼代培養(yǎng)。而子葉誘導的愈傷組織無論從顏色，數量和質量上都相對較好，而且其實生苗利用率較高，每株無菌實生苗上可獲取6-8個。前期實驗表明，子葉中的總黃酮含量高于下胚軸，因此，確定子葉為愈傷組織誘導的最佳外植體。

表1 不同類型外植體對愈傷組織誘導的影響Tab.1 Effect of different explants on cullus induction

2.2 愈傷組織繼代培養(yǎng)激素配比的優(yōu)化

2.2.1 6-BA對愈傷組織凈增鮮重的影響 將初代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織6.00 g，置于培養(yǎng)瓶內，在固定條件下:IAA為0.5 mg/L，AgN03為1 mg/L條件下，選擇不同激素濃度 0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8 mg/L條件下，考察6-BA對愈傷組織凈增鮮重的影響，結果見圖1。

圖1 不同濃度6-BA對愈傷組織凈增鮮重的影響Fig.1 Effects of different 6-BA on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

由圖1可知，隨著6-BA濃度的增大，愈傷組織凈增鮮重不斷增加，當濃度增加到1.0 mg/L時，凈增鮮重開始下降。這也正符合激素誘導愈傷組織的一般規(guī)律，雖然其中促進細胞分裂，促進非分化組織分化，促進生物體內物質的積累。但6-BA的另一個重要特征是在植物體內的移動性差，其生理作用局限于處理部位及其附近，而且隨著6-BA濃度的增加愈傷組織有褐化的趨勢，褐化會影響組織分化，進而影響愈傷組織凈增鮮重。因此認為6-BA濃度1.0 mg/L左右為宜。

2.2.2 IAA對愈傷組織凈增鮮重的影響 將初代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織6.00 g，置于培養(yǎng)瓶內，在固定條件下:6-BA 為1.0 mg/L，AgN03為 1.0 mg/L 條件下，選擇不同激素濃度 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mg/L條件下，考察IAA對愈傷組織凈增鮮重的影響，結果見圖2。

圖2 不同濃度IAA對愈傷組織凈增鮮重的影響Fig.2 Effects of different IAA on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

由圖2可知，隨著IAA濃度的增大，愈傷組織凈增鮮重不斷增加，當濃度增加到0.5 mg/L時，凈增鮮重開始緩慢，而當濃度達到0.9 mg/L時，凈增鮮重顯著下降。不同種類的外源激素對黃瓜愈傷的誘導和分化作用是不同的，IAA通過改變愈傷組織中內源激素含量而起作用的。主要可能通過影響有關激素“庫”大小的酶活性(過氧化物酶和IAA氧化酶)實現(xiàn)的。本實驗中即使較低濃度的IAA也能誘導出較高量的愈傷組織?？梢姡鷤M織的增值是受組織內激素IAA的濃度調控的，認為IAA濃度0.5 mg/L左右為宜。

2.2.3 AgN03對愈傷組織凈增鮮重的影響 將初代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織6.00 g，置于培養(yǎng)瓶內，在固定條件下:6-BA 為1.0 mg/L，IAA 為0.5 mg/L條件下，選擇不同激素濃度 0.5、0.7、0.9、1.0、1.2、1.5 mg/L條件下，考察AgN03對愈傷組織凈增鮮重的影響，結果見圖3。

圖3 不同濃度AgN03對愈傷組織凈增鮮重的影響Fig.3 Effects of different AgN03on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

從圖3可以看出，隨著AgN03的增加，愈傷組織的凈增鮮重也隨之增加，當濃度達到1 mg/L時，凈增鮮重有下降的趨勢。本研究中添加AgNO3提高了愈傷組織誘導率，這主要是低濃度的AgNO3能夠有效抑制培養(yǎng)物形成乙烯，減少組織老化變褐，誘導愈傷組織的發(fā)生［11］。但當AgNO3濃度高于1.0 mg/L后，對愈傷組織生長可能轉成了抑制作用，這可能是濃度過高降低了激素的水平，產生了毒害作用［12］。

2.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)激素配比的優(yōu)化

2.3.1 響應面分析方案及試驗結果 在單因素試驗基礎上，選擇6-BA，IAA，AgN03為自變量，根據中心組合(Box-Behnken)試驗設計原理采用三因素五水平的響應面分析法，確定愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素組合的最佳配比。利用 De-sign Expert7.0軟件進行數據擬合，其具體試驗方案及結果見表2、3。

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert軟件對表2試驗數據進行二次多項式逐步回歸擬合，得到數學模型為:Y=23.03+0.084X1+0.059X2+0.088X3+0.013X1X2+0.013X1X3+0.013X2X3 －1.17X12－0.070X22－0.18X32。對表3中的試驗結果進行統(tǒng)計分析，得到的方差分析結果如表4所示。由表4可知，6-BA，IAA，AgN03的一次項，平方項均達到顯著水平(P＜0.05)。由 F值可知，各因素對愈傷組織凈增鮮重的影響次序為:6-BA(X3)＞AgN03(X1)＞IAA(X2)。此模型的決定系數R2為0.9957，經擬合檢驗可知該二次方程模型達到極顯著水平，并且失擬項不顯著，說明該方程與實際情況擬合很好，能夠正確反映愈傷組織凈增鮮重與6-BA，IAA，AgN03激素之間的關系。

表2 因素水平編碼表Tab.2 Coding of factors and levels

表3 試驗設計方案及試驗結果Tab.3 Test designs and results

表4 回歸模型各項的方差分析Tab.4 Variance analysis of regression equation

2.3.3 響應面分析 根據回歸方程，做出各個激素組合對黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應面和等高線，考察擬合響應曲面的形狀，分析6-BA，IAA，AgN03三種激素濃度對黃瓜愈傷組織凈增鮮重的影響，見圖4～6。等高線圖直觀地反映出三種激素的交互作用對愈傷組織凈增鮮重的影響。橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示兩因素之間的交互作用不明顯。由圖可以看出，6-BA和IAA，6-BA和AgN03的交互作用顯著，IAA和AgN03交互作用較小。

圖4 6-BA和IAA對黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour for effects of 6-BA and IAA on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

圖5 6-BA和AgN03對黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour for effects of 6-BA and AgN03on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

圖4～6直觀地反映了各激素對凈增鮮重的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。比較3組圖可知:6-BA對黃瓜愈傷組織凈增鮮重影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;而 IAA和AgN03，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。同時也說明了6-BA是黃瓜脫分化過程中必須激素之一。

2.3.4 最佳激素的配比及驗證 為進一步確定最佳的激素濃度，在模型濃度范圍內選擇出發(fā)點，按照模型使用快速上升法優(yōu)化，可得愈傷組織凈增鮮重的最佳激素配比為:6-BA為1.0091 mg/L，IAA為0.5502 mg/L，AgN03為 1.1026 mg/L，在此最佳激素配比下愈傷組織凈增鮮重的理論提取率23.14 g。在此激素條件下，實際測得的平均提取率23.13 g，與預測值基本一致，證實了該模型的有效性。因此選出的培養(yǎng)基 MS+6-BA1.009 mg/L+IAA 0.5502 mg/L+AgN031.1026 mg/L為黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)的黃瓜愈傷組織為黃綠色，質地緊密，數量較多。在最佳激素濃度組合后的培養(yǎng)基上誘導出的愈傷組織見圖7A。

圖6 IAA和AgN03對黃瓜愈傷組織凈增鮮重的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour for effects of IAA and AgN03on net fresh weight extraction rate of cucumber callus

2.3.5 黃瓜細胞懸浮培養(yǎng) 將最佳培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好的愈傷組織，接種到不加瓊脂的液體培養(yǎng)基:MS+6-BA 1.009 mg/L+IAA 0.5502 mg/L+AgN031.1026 mg/L中進行黃瓜細胞的液體懸浮培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，懸浮細胞可不斷增值，生長速度快，狀態(tài)良好，懸浮細胞見圖7B。

圖7 最佳培養(yǎng)基的黃瓜愈傷組織及細胞懸浮培養(yǎng)Fig.7 Cucumber callus induced under optimized culture condition and cucumber suspension cells of cucumber

3 結論

本試驗通過黃瓜外植體的不同部位的愈傷組織誘導情況，得出子葉為愈傷組織誘導的最佳外植體。在愈傷組織繼代培養(yǎng)激素優(yōu)化的過程中采用響應面分析方法，確定的數學模型為:Y=23.03+0.084X1+0.059X2+0.088X3+0.013X1X2+0.013X1X3+0.013X2X3 －1.17X12－0.070X22－0.18X32。通過模擬尋優(yōu)得到的黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為:MS+6-BA1.009 mg/L+IAA 0.5502 mg/L+AgN031.1026 mg/L，并且得到黃瓜最大愈傷組織凈增鮮重為23.14 g。通過驗證實驗在篩選出的最佳培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到的黃瓜愈傷組織凈增鮮重為23.13 g，與預測值基本一致。此結果說明，利用響應面設計對黃瓜愈傷組織增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化是可行的，同時在最佳培養(yǎng)基進行黃瓜細胞的懸浮培養(yǎng)，增值速度快，生長狀態(tài)良好，為進一步研究黃瓜懸浮細胞培養(yǎng)生產次生代謝產物奠定基礎。

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