AtNDPK2基因轉(zhuǎn)化敖漢苜蓿及其耐鹽性分析＊

王麗娜，王麗艷，劉景文，郭永霞*，金 勛，芮海英

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319;3.大慶市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，黑龍江 大慶 163319)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和強(qiáng)大生態(tài)功能的優(yōu)質(zhì)牧草，被全世界廣泛種植。然而，近年來(lái)隨著全球生態(tài)環(huán)境的日益惡化，出現(xiàn)的低溫﹑鹽漬﹑干旱等非生物脅迫環(huán)境，嚴(yán)重威脅紫花苜蓿的生長(zhǎng)，限制了牧草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。黑龍江省鹽堿地總面積約占188萬(wàn)公頃［1］，尤其西部地區(qū)的肇源﹑安達(dá)、大慶是重要的畜牧生產(chǎn)基地，也是鹽堿化較重，面積較大的區(qū)域，pH都達(dá)到了8.0以上［2］。為了保證該地域畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，還需要充分的利用和改良鹽堿地來(lái)提高牧草的生產(chǎn)率?，F(xiàn)代分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的結(jié)合，通過(guò)向牧草中導(dǎo)入抗逆相關(guān)目的基因，獲得抗逆性更強(qiáng)的牧草新品種，對(duì)提高牧草抗逆性和產(chǎn)量有重要意義。

近年來(lái)，與植物抗逆性相關(guān)的基因核苷二磷酸激酶(NDPKs)在轉(zhuǎn)基因工程中備受關(guān)注，其是一種由數(shù)個(gè)16-20 kD多肽組成的70-100 kD的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核和真核生物中［3］，它不僅作為一種“看家酶”來(lái)維持細(xì)胞NDP和NTP的代謝平衡，而且還是一組多功能蛋白酶，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化并與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，參與熱脅迫響應(yīng)以及H2O2介導(dǎo)的氧化脅迫響應(yīng)等等［4-6］。植物中 NDPKs大體上分為NDPK1，NDPK2，NDPK3三種類型，其中 NDPK2與多種脅迫響應(yīng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)NDPK2基因的擬南芥能夠耐受－7℃低溫脅迫1 h，離體葉片耐受1 μmol·L-1甲基紫精(MV)7 d［7］;轉(zhuǎn) AtNDPK2 基因的馬鈴薯能夠耐受80 mmol·L-1NaCl脅迫及42℃高溫脅迫［8］。這些研究結(jié)果充分說(shuō)明NDPK2的過(guò)量表達(dá)能夠通過(guò)調(diào)解氧化還原系統(tǒng)來(lái)提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫、高鹽和氧化等非生物脅迫的抗性。

本研究的主要目的是將甘薯過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子(SWPA2)驅(qū)動(dòng)下的AtNDPK2基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入紫花苜蓿受體系統(tǒng)中，建立轉(zhuǎn)化體系;利用PCR技術(shù)初步檢測(cè)出陽(yáng)性植株，并對(duì)獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鹽脅迫分析，確定該基因的轉(zhuǎn)化是否增強(qiáng)了苜蓿植株的耐鹽性，為后期苜蓿新種質(zhì)遺傳選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿品種“敖漢”由黑龍江省畜牧研究所提供;含有目的基因AtNDPK2的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300由韓國(guó)生命工學(xué)研究院郭尚珠教授惠贈(zèng)(圖1-1A，1B)，可用于遺傳轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacferium tumefaciens)菌株EHA105由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)分子實(shí)驗(yàn)室建立并保存。

圖1 -1A pCAMBIA2300質(zhì)粒載體圖譜Fig.1 -1A Plasmid vector map of pCAMBIA2300

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化及再生植株的獲得

農(nóng)桿菌EHA105經(jīng)活化后，當(dāng)菌液的OD600為0.6～0.8時(shí)，侵染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)3～5 d的下胚軸10～15 min后，轉(zhuǎn)接到含有50 mg·L-1乙酰丁香酮(AS)和2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT 的改良 SH 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2～3 d，經(jīng)Cef脫菌后先轉(zhuǎn)接到僅含350 mg·L-1Cef和 2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT的改良SH培養(yǎng)基上進(jìn)行一段時(shí)間培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan以及0.1 mg·L-1KT改良的 SH培養(yǎng)基上誘導(dǎo)抗性分化芽，待抗性分化芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)隨后將其轉(zhuǎn)接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)生根苗，培養(yǎng)14 d左右長(zhǎng)至2～3條根后馴化移栽。

1.3 抗性植株的分子生物學(xué)鑒定

圖1 -1B 含有AtNDPK2基因的質(zhì)粒載體Fig.1 -1B The vector structure with AtNDPK2 gene

利用CTAB法提取苜蓿植株葉片的基因組DNA，以AtNDPK2基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游:5'-CACCATGGTGGGAGCGACT-3'，下 游:5'-TCTGTCTAGACAAGGATCA-3'，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL):DNA模板1 μL，上游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)2 μL，10 ×loading buffer 2.5 μL，Taq 酶 2.5 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸8 min，4℃終止保存。電泳及凝膠成像觀察擴(kuò)增出來(lái)的目的條帶的分子量大小是否在540 bp左右。

1.4 轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性分析

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因苜蓿經(jīng)組織培養(yǎng)后，將獲得的組培苗轉(zhuǎn)接到含有0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0%NaCl的 1/2MS 的培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽脅迫處理，每處理重復(fù)3次(瓶)，每重復(fù)(瓶)4株，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2000～3000 lx，光周期時(shí)間16 h/8 h。經(jīng)3周鹽脅迫后各處理分別取樣。

1.5 各生理生化指標(biāo)的測(cè)定

利用氮藍(lán)四唑法［9］和愈創(chuàng)木酚法［10］測(cè)定超氧化物酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性，利用電導(dǎo)儀法［9］測(cè)定質(zhì)膜透性及硫代巴比妥酸(TBA)比色法［11］測(cè)定丙二醛含量，每處理重復(fù)測(cè)定3次，取3次平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因苜蓿的獲得

通過(guò)農(nóng)桿菌EHA105(pCAMBIA2300)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因“敖漢”苜蓿23株，轉(zhuǎn)化率為23.3%。

2.2 抗性植株的PCR檢測(cè)

因AtNDPK2基因片段的擴(kuò)增條件已經(jīng)很明確，所以設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照。對(duì)獲得的23株抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果有20個(gè)株系擴(kuò)增出了約530 bp左右的目的片段，轉(zhuǎn)化率為86.9%(圖2-1部分結(jié)果圖片)。初步表明AtNDPK2基因已經(jīng)整合到“敖漢”苜蓿的基因組中。

2.3 鹽脅迫下苜蓿植株的生長(zhǎng)狀況

將轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的組培苗進(jìn)行擴(kuò)繁后，選擇大小形態(tài)一致的再生苗進(jìn)行不同濃度的鹽脅迫處理，非轉(zhuǎn)基因組培苗作為對(duì)照。發(fā)現(xiàn)NaCl濃度為0% ～0.4%處理中，兩者之間組培苗的大小形態(tài)沒(méi)有明顯的變化。隨著處理濃度增大，NaCl濃度為0.6%處理中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片水浸狀、萎蔫數(shù)量明顯的少于對(duì)照，并頂部葉片處于平展?fàn)顟B(tài)，而對(duì)照組葉片呈現(xiàn)水浸狀，萎蔫數(shù)量多，頂部葉片卷曲(圖2-2)。隨著鹽濃度加大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)照組植株在NaCl濃度≧0.6%逐漸黃化死亡，轉(zhuǎn)基因組培苗葉片呈現(xiàn)水浸、萎蔫、卷曲的數(shù)量隨濃度升高而增多，在NaCl濃度達(dá)到1.0%處理中沒(méi)有死亡現(xiàn)象發(fā)生。由此說(shuō)明了AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)化增強(qiáng)了苜蓿應(yīng)對(duì)高鹽濃度的耐受性，葉片受脅迫響應(yīng)出現(xiàn)癥狀明顯。

2.4 鹽脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)含量變化

轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株在0%～0.2%NaCl處理濃度下，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)相對(duì)滲出率較低，兩者之間相對(duì)電導(dǎo)率沒(méi)有明顯的差異。隨著鹽濃度的升高非轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)膜相對(duì)電導(dǎo)率顯著增大，而轉(zhuǎn)基因植株相比于0% ～0.2%NaCl處理增大的幅度不明顯，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電導(dǎo)率相比較非轉(zhuǎn)基因植株顯著降低最后趨于平穩(wěn)。在非轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛含量的變化趨勢(shì)為隨著鹽處理濃度的升高，丙二醛含量是逐漸升高的，而轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量在0.2%NaCl處理下與非轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有顯著的差異，當(dāng)鹽濃度＞0.2%時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株相比較非轉(zhuǎn)基因植株丙二醛含量明顯降低，與非轉(zhuǎn)基因植株呈顯著性的差異，隨著鹽處理濃度的增大轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量趨于平穩(wěn)(圖2-3)。電解質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量是衡量植物質(zhì)膜完整性和膜質(zhì)過(guò)氧化程度的標(biāo)準(zhǔn)，該結(jié)果表明高鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜受傷害小，細(xì)胞膜完整性較好，膜質(zhì)的過(guò)氧化程度低，植株遭受損害輕，NDPK2基因的過(guò)量表達(dá)提高了植株的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫下超氧化物酶(SOD)活性變化

轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株在0%～0.2%鹽脅鹽脅迫下維持正常生理活動(dòng)，提高植株耐鹽能力。

圖2-1 轉(zhuǎn)AtNDPK2植株的基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增的目的基因Fig.2-1 Genomic DNA extracted of AtNDPK2 and the target gene of PCR amplifing

圖2-2 鹽脅迫下非轉(zhuǎn)基因植株(A)，轉(zhuǎn)基因植株(B)的表現(xiàn)形態(tài)Fig.2-2 The performance of non-transgenic plant(A)，transgenic plant(B)under salt stress

2.6 鹽脅迫下過(guò)氧化物酶(POD)活性變化

圖2-3 鹽脅迫下植株相對(duì)電導(dǎo)率(%)和丙二醛含量(%)的變化Fig.2-3 The changes relative elecrtrical conductivity(%)and MDA(%)of plant under salt stress

非轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因植株在不同的鹽濃度下POD的活性變化各不相同，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.4%時(shí)非轉(zhuǎn)基因植株的POD活性達(dá)到最大值，隨著鹽濃度的不斷增加，非轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD活性不斷下降;而轉(zhuǎn)基因植株的POD活性一直維持在較高水平。POD也是一種植物細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)性酶，不僅與植物抵御不良環(huán)境條件有關(guān)，而且它還與植物抵御各種病害和環(huán)境中某些營(yíng)養(yǎng)元素脅迫以及植物抗衰老有關(guān)。大部分試驗(yàn)證明，POD活性越高，植株的抗逆性越強(qiáng)。該迫條件下超氧化物酶(SOD)的活性都沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，當(dāng)鹽處理濃度≥0.4%的時(shí)，兩者的SOD酶活性顯著增高。隨鹽濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因植株SOD活性呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度為1.0%時(shí)SOD酶活性最低;而轉(zhuǎn)基因植株SOD活性則呈現(xiàn)出不斷升高，SOD活性顯著的高于非轉(zhuǎn)基因植株，并隨鹽濃度增大而趨于平穩(wěn)(圖2-4)。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，能夠有效清除因脅迫或損傷造成的細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基或過(guò)氧化物，使它們維持較低水平，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到危害。該結(jié)果說(shuō)明了SOD活性越高越有利于轉(zhuǎn)基因植株在結(jié)果說(shuō)明了POD酶活性越高，植株細(xì)胞損傷程度越小，從而提高了苜蓿的耐鹽性。

3 討論

近年來(lái)，對(duì)于紫花苜蓿植株的遺傳轉(zhuǎn)化研究比較廣泛，轉(zhuǎn)化的基因類型主要包括品質(zhì)改良，抗病、蟲害，抗除草劑，抗逆相關(guān)基因以及作為生物反應(yīng)器等［12］。其中對(duì)于抗逆基因的轉(zhuǎn)化研究比較深入。大多數(shù)研究結(jié)果表明植株的抗逆性往往是受多基因控制的，單一功能基因的導(dǎo)入，并不能達(dá)到預(yù)期的效果。本實(shí)驗(yàn)選用甘薯過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子(SWPA2)，SWPA2是一種較強(qiáng)的脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，更加適用于培育耐環(huán)境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物研究［13，14］。NDPK2又是一種促進(jìn)多種抗氧化酶表達(dá)的抗逆基因［15］。兩者組合達(dá)到了提高抗逆性的雙重功效，這將對(duì)增強(qiáng)苜蓿轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性具有重要意義。

圖2-4 鹽脅迫下植株超氧化物酶(SOD)活性變化Fig.2-4 The changes SOD activity of plant under salt stress

圖2-5 鹽脅迫下植株過(guò)氧化物酶(POD)活性變化Fig.2-5 The changes POD activity of plant under salt stress

基因的轉(zhuǎn)化是否增強(qiáng)了植株的耐鹽性，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了耐鹽性驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株受到0.4% ～1.0%NaCl脅迫時(shí)，SOD、POD活性上升，非轉(zhuǎn)基因植株的SOD、POD也在逐漸上升只是兩者的活性表現(xiàn)上升幅度不同，轉(zhuǎn)基因植株酶活性始終高于非轉(zhuǎn)基因植株。當(dāng)NaCl濃度0.6%脅迫7 d時(shí)發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)了葉片呈現(xiàn)水浸、卷曲、萎蔫癥狀，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)不明顯。SOD，POD是清除活性氧自由基的關(guān)鍵酶［16，17］，在氧化脅迫反應(yīng)早期起主要調(diào)節(jié)作用［18］，所以該生理生化指標(biāo)可用來(lái)衡量植株的耐鹽性。轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)膜相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量也表現(xiàn)出顯著性差異，隨著鹽濃度的增加，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株，而非轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。相對(duì)電導(dǎo)率變化可反映質(zhì)膜的破壞程度及植株的抗逆性強(qiáng)弱［19-21］，丙二醛含量變化也可反映植物遭受逆境傷害的程度［22］。該試驗(yàn)獲得的結(jié)果充分說(shuō)明在高濃度鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度低，膜結(jié)構(gòu)受到的傷害較小，質(zhì)膜的選擇透性強(qiáng)，植株受損程度小，進(jìn)一步證實(shí)了AtNDPK2基因的轉(zhuǎn)入提高了轉(zhuǎn)基因“敖漢”苜蓿的耐鹽性。農(nóng)桿菌EHA105菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化SWPA2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的AtNDPK2基因增強(qiáng)了“敖漢”苜蓿植株的耐鹽性。

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