正常和癌變胃粘膜組織的共焦拉曼光譜初探＊

陳 瑤，代劍華，張 華，周學(xué)謙，劉云杰，彭貴勇*

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍消化病研究所，重慶 400038;2.中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院跨尺度制造技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400714)

0 引言

胃癌是人類最常見的癌癥之一，在癌癥相關(guān)死亡率中位居第二。而胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后密切相關(guān)。早期胃癌的5年存活率大于90%，而一旦有深層胃壁浸潤或有局部淋巴結(jié)累及，5年生存率降至20-30%［1-3?。因此早期發(fā)現(xiàn)在提高胃癌的存活率中具有重大意義。

胃癌的檢測主要依靠影像學(xué)及內(nèi)窺鏡，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)則是病理活檢。我們已知，影像學(xué)檢測大多都是在組織形態(tài)發(fā)生異常改變后才可以探測到，PET-CT(正電子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像)雖然可以檢測組織細(xì)胞的代謝改變，但分辨率也只有4-7 mm，且假陽性較高，費(fèi)用昂貴。內(nèi)窺鏡下活檢部位的選擇依靠內(nèi)鏡醫(yī)師的主觀判斷，且活檢有出血、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。拉曼光譜可以對生物樣品進(jìn)行實(shí)時、快速檢測，不受水的干擾，適用于體內(nèi)活體診斷。不但對結(jié)構(gòu)改變敏感，可以反映物質(zhì)內(nèi)部分子生化改變，且光譜圖簡單，譜峰銳利，利于分析。之前對乳腺癌、皮膚癌、喉癌等組織的拉曼光譜相關(guān)研究顯示，正常和癌變組織的拉曼光譜存在明顯差別［4-7?。本研究對正常和癌變粘膜組織的拉曼光譜進(jìn)行分析研究，為拉曼光譜用于臨床檢測研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 拉曼光譜設(shè)備

激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(RENISHAW):二極管激光器，激發(fā)波長785 nm，分辨率1-2 cm-1，最大激發(fā)光功率約300 mW，最大波譜范圍100-3200 cm cm-1，光柵:1200、1800、2400，并配置有高性能 Leica顯微鏡，XYZ三維樣品臺等。

1.2 標(biāo)本收集

圖1 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(RENISHAW)Fig.1 Laser confocal microscope raman spectrometer

標(biāo)本均來自2012-2013年于西南醫(yī)院行胃鏡檢查的患者。檢查前均取得患者知情同意并簽署相關(guān)知情同意書。本研究已通過倫理委員會的審查。共收集19例正常胃粘膜組織和12例胃癌粘膜組織。包括17男14女、平均年齡55.55±14.73歲，標(biāo)本采集后立即置入1.8 mL凍存管封裝后置入冰塊中保存，帶至拉曼光譜實(shí)驗(yàn)室檢測(標(biāo)本檢測時離體時間約1 h)。各標(biāo)本均經(jīng)病理確診。

1.3 拉曼光譜測定

顯微共焦拉曼光譜儀參數(shù)設(shè)置:曝光時間20 s，累積次數(shù)2次，激發(fā)光功率30 mW，光柵1200，波普采集范圍800-1800 cm-1。測量前用硅片校準(zhǔn)儀器。儀器校準(zhǔn)后，將標(biāo)本從凍存管中取出，平鋪于載玻片上，對每例標(biāo)本隨機(jī)選取1個點(diǎn)進(jìn)行采集，共獲得31個拉曼光譜圖(包括12個胃癌和19例正常)。激光共焦顯微拉曼光譜儀如圖1。

1.4 根據(jù)拉曼光譜原理及參考文獻(xiàn)總結(jié)人體組織拉曼光譜譜峰歸屬

當(dāng)入射光與樣品分子發(fā)生能量交換(非彈性碰撞)則會產(chǎn)生頻率發(fā)生改變的散射光，即拉曼散射。入射光的頻率(v0)與散射光的頻率(vib)之差即拉曼位移(△v，△v=v0-vib)。對于同一物質(zhì)，拉曼位移只和樣品分子的振動有關(guān)，與入射光的頻率無關(guān)(拉曼位移即波數(shù)=1 cm/v0-vib)［8］。拉曼位移頻率等于分子官能團(tuán)的振動頻率。組成分子的各種官能團(tuán)如 C=O、C-N、C=C、C-H、苯環(huán)等都有其各自特定的拉曼位移峰，分子其他部分對該峰的位置影響很小，這種有特定峰形或較高強(qiáng)度的峰，代表某種特定官能團(tuán)存在，稱作官能團(tuán)特征振動峰，峰所在的位置稱特征振動波數(shù)。參考文獻(xiàn)［9-18］，總結(jié)人體組織拉曼光譜譜峰歸屬。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

所獲原始光譜數(shù)據(jù)均予以強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化、減掉基線背景等處理。并采用 spss、excell、NGS-Labspec等軟件分析處理。尋找胃正常和癌變粘膜組織的拉曼特征峰，計算特征峰平均位移、相對峰強(qiáng)比等。比較分析相對峰強(qiáng)，結(jié)合兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，繪制ROC曲線等。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 人體組織拉曼光譜譜峰歸屬

具體歸屬見表1。

表1 人體組織的拉曼光譜譜峰歸屬Tab.1 Raman peaks assignment of human tissues

2.2 正常和癌變胃粘膜組織的拉曼特征峰分析

本次研究所測得正常和癌變胃粘膜組織的全部光譜分別如圖2和3所示，平均光譜如圖4和5所示。由平均光譜分析可見，癌變胃粘膜的拉曼光譜發(fā)生了明顯改變。正常和癌組織中853 cm-1、939 cm-1、1004 cm-1、1128 cm-1處譜峰位置固定，表明測量前儀器校正準(zhǔn)確，癌變組織的拉曼特征峰位移有意義。檢測所獲具體特征峰分布如下表2所示。由表可以看出，拉曼特征峰主要分布于800-1300 cm-1之間。除 1660 cm-1、1241 cm-1、1207 cm-1、1156 cm-1之外，正常胃粘膜組織特征峰相對強(qiáng)度大于胃癌。和正常相比，癌變胃粘膜中特征峰平均位移2.57 ±1.28 cm-1。除 829 cm-1、1800 cm-1發(fā)生了藍(lán)移(向低波數(shù)移動)之外，癌組織特征峰主要發(fā)生了紅移(與藍(lán)移相反)。而我們已知紅移主要是基團(tuán)的活化、扭曲、吸附等，導(dǎo)致振動的能量減少;而藍(lán)移則表示振動的能量增加，可能是引入了新的基團(tuán)或化學(xué)鍵，或是由于周邊的基團(tuán)的活化，是其振動更加穩(wěn)定。與正常組織相比，胃癌增加了特征峰1263 cm-1、1586 cm-1，同時減少了特征峰 956 cm-1、1172 cm-1。我們已知，這幾個特征峰均表征蛋白質(zhì)，提示癌組織內(nèi)部蛋白質(zhì)組成發(fā)生了改變。

2.3 相對峰強(qiáng)比區(qū)分正常和癌變胃粘膜組織

所有光譜的I1087cm-1/I1207cm-1如下表3所示。采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃粘膜相對強(qiáng)度比I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌和正常胃粘膜組織中存在明顯差別(P＜0.05)，胃癌中 I1087cm-1/I1207cm-1≥1.87(平均值 1.05 ± 0.30)，而胃正常粘膜組織中 I1087cm-1/I1207cm-1＜1.87(平均值 0.39±0.09)。I1087cm-1/I1207cm-1區(qū)分胃癌和正常胃粘膜組織的準(zhǔn)確率、靈敏度和特異度分別為87.1%、83.3%、89.5%，如圖6ROC曲線所示。

圖2 胃癌的拉曼光譜(n=12)Fig.2 Raman spectrums of gastric cancer(n=12)

圖3 胃正常粘膜組織的拉曼光譜(n=19)Fig.3 Raman spectrums of gastric normal tissues(n=19)

圖4 胃癌和胃正常粘膜組織的平均拉曼光譜Fig.4 Average Raman spectrum of malignant and normal gastric tissues

表2 正常和癌變胃粘膜的拉曼特征峰Tab.2 Characteristic raman peaks of normal and malignant gastric tissues

圖5 拉曼光譜(胃正常-胃癌，平均)Fig.5 Raman spectrum(gastric normal-cancer，average)

3 討論

胃癌的發(fā)生伴隨一系列生理生化代謝改變，如DNA解聚并大量復(fù)制、相關(guān)酶的合成等，其組分如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子比例組成、內(nèi)部化學(xué)鍵及分子之間官能團(tuán)相互作用也隨之改變，從而引起拉曼光譜呈現(xiàn)出相應(yīng)特征性改變。不僅可以通過癌變特征光譜區(qū)分正常和癌變，而且可以探索發(fā)現(xiàn)癌變的分子起源。目前胃粘膜癌變的拉曼光譜檢測分析逐漸引起研究者們的關(guān)注。代劍華等［19］提取正常胃粘膜、腸化胃粘膜、胃腺癌細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行拉曼光譜分析，推測三種細(xì)胞DNA的磷酸骨架鏈由穩(wěn)定、不穩(wěn)定發(fā)展到斷裂。Z Huang等［20］研究發(fā)現(xiàn)正常胃粘膜和異型增生胃粘膜的拉曼光譜有特征性差別，如特征峰1450 cm-1及1305 cm-1的相對峰強(qiáng)在異型增生的胃粘膜中明顯增加，I875cm-1/I1450cm-1作為診斷法則，鑒別異型增生和正常組織的靈敏度及特異度分別達(dá)到85.7%和80.0%。而我們已知胃粘膜癌變大都由異型增生發(fā)展而來。因此，我們對正常和癌變胃粘膜的拉曼光譜進(jìn)行了初步分析研究。

表3 相對峰強(qiáng)比(I1087 cm-1/I1207 cm-1)Tab.3 Ratio of relative peak intensity(I1087 cm-1/I1207 cm-1)

圖6 ROC曲線來自于兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，曲線下面積為0.908，充分說明了I1087/I1207鑒別胃正常和癌變粘膜組織的有效性Fig.6 The receiver operating characteristic(ROC)curve generated from the two independent T-test，the integration area under curve(AUC)is 0.908，inllustrating the efficacy of I1087 cm-1/I1207 cm-1in differentiating malignant from normal gastric tissues

由此次研究中正常和癌變胃粘膜的拉曼光譜對比分析可以發(fā)現(xiàn)，在相同檢測條件下，胃癌的總體拉曼峰強(qiáng)度小于正常胃粘膜組織。我們已知胃癌組織血供豐富，而紅細(xì)胞富含卟啉，卟啉為強(qiáng)熒光物質(zhì)，可能因此掩蓋了部分拉曼信號。

與正常胃粘膜組織相比，胃粘膜癌變后特征峰主要向高波數(shù)移動，即發(fā)生了紅移，振動能量降低?？赡馨┙M織中分子內(nèi)部化學(xué)鍵、官能團(tuán)等有更多的振動模式，一致性降低，振動能量降低。提示組織細(xì)胞癌變中，不僅宏觀形態(tài)如組織形態(tài)、細(xì)胞排列、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)等發(fā)生了異常，其微觀組成如分子內(nèi)部化學(xué)鍵、基團(tuán)之間的相互作用等也發(fā)生了相應(yīng)改變。進(jìn)一步證實(shí)了拉曼光譜可以在分子生化水平跟蹤監(jiān)測癌變。

特征峰1263 cm-1、1586 cm-1僅在胃癌組織中出現(xiàn)，而正常組織中不明顯。已知1263 cm-1來自于N-H的彎曲振動和C-H的伸縮振動［21］，表明某種蛋白質(zhì)的構(gòu)型構(gòu)象發(fā)生了改變，導(dǎo)致某些氨基酸側(cè)鏈的暴露活化，出現(xiàn)了新的振動頻移位點(diǎn);也可能是由于癌組織細(xì)胞活躍的增殖過程中合成了某種新的蛋白質(zhì)。相反，特征峰1172 cm-1、955 cm-1僅在正常胃組織中出現(xiàn)，而在胃癌中這兩個特征峰不明顯。已知1172 cm-1主要是來自芳香族氨基酸的C-H面內(nèi)彎曲振動［15］，提示胃癌組織中芳香族氨基酸與鄰近分子相互作用增強(qiáng);也可能是胃癌組織中芳香族氨基酸含量減少。我們已知組織細(xì)胞內(nèi)部蛋白質(zhì)的含量及種類非常豐富，我們的研究結(jié)果提示癌組織中蛋白質(zhì)的組成比例、種類、構(gòu)型等發(fā)生了改變。表明拉曼光譜在探索分析癌變組織細(xì)胞內(nèi)部如蛋白質(zhì)、DNA等大分子物質(zhì)的相對含量、結(jié)構(gòu)特征、存在狀態(tài)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

由表3可見，與正常胃粘膜組織相比，I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌中明顯大于正常組織。而我們已知，1087 cm-1表征核酸，1207 cm-1表征蛋白質(zhì)，提示相對于蛋白質(zhì)，核酸相對含量增加更明顯。反映了癌細(xì)胞有絲分裂活躍，核酸的含量明顯增加。在隨后深入的研究中，我們會增加樣本量，進(jìn)一步證實(shí)這個結(jié)論。

本研究通過對比分析胃正常和癌變粘膜組織的拉曼光譜差異，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析，區(qū)分胃正常和癌變粘膜組織，并初步探索癌變相關(guān)的分子生化改變，主要結(jié)果如下:1.和正常相比，胃癌組織的拉曼特征峰主要向高波數(shù)發(fā)生位移，提示胃癌組織內(nèi)部分子化學(xué)鍵或官能團(tuán)的振動模式多樣化。2.特征峰1263 cm-1和1586 cm-1僅在胃癌中出現(xiàn)，正常組織中不明顯;與此相反，955 cm-1僅在正常組織中出現(xiàn)，而胃癌中不明顯。提示胃癌組織內(nèi)部大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等的相對含量、構(gòu)型構(gòu)象、存在狀態(tài)等發(fā)生了改變。3.相對峰強(qiáng)比I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌和正常胃粘膜組織中存在明顯差別(P＜0.05)，胃癌中 I1087cm-1/I1207cm-1≥1.87，其鑒別胃癌和正常胃粘膜組織的準(zhǔn)確率、靈敏度和特異度分別高達(dá)87.1%、83.3%、89.5% 。

因此，拉曼光譜檢測胃癌和正常胃粘膜組織，不僅可通過相對峰強(qiáng)比等鑒別癌變，還可通過光譜探索癌變組織細(xì)胞內(nèi)部的分子生化改變。提示拉曼光譜在胃癌的跟蹤監(jiān)測、臨床診斷和基礎(chǔ)研究中具有良好應(yīng)用前景。

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