納米氧化硅空心球負載光敏劑對肝癌體內外的殺傷作用研究＊

劉忠濤，劉志鵬，熊 力，苗雄鷹，林良武，文 宇*

(中南大學 a.湘雅二醫(yī)院普外科;b.中南大學粉末冶金國家重點實驗室，湖南 長沙 410083)

0 引文

原發(fā)性肝癌是世界上發(fā)病率和死亡率均較高的十大惡性腫瘤之一［1，2］。我國肝癌病例數約占全世界肝癌總例數的43.7%，肝癌死亡率居我國惡性腫瘤病死率的第 2 位，為 20.37/10 萬人［l，3］，而且肝癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，因此嚴重威脅我國人民的健康。然而原發(fā)性肝癌發(fā)病比較隱匿，早期診斷比較難，且多數在肝硬化基礎上發(fā)病，因此治療困難、而且臨床肝癌診療中還存在著復發(fā)轉移率高。治療缺乏針對性、源頭創(chuàng)新藥物和治療手段少等問題，因此對肝癌診治新技術、新療法的研究尤為重要和迫切［4］。

PDT是一種臨床認可的，副作用較小，并且可以選擇性殺死腫瘤細胞的治療，是近20年來發(fā)展起來的一種新的治療惡性腫瘤的方法，現(xiàn)已證明對多種實體腫瘤具有良好的治療效果［5，6］。但早期主要用于體表和腦內腫瘤，對肝臟腫瘤等腹腔內腫瘤的治療的相關研究較少。PDT治療分為兩個過程:人實施了對光敏感的光敏劑后，光通過光纖到達人體的腫瘤部分，以適當波長的光照射，使光敏劑活化，活化的光敏劑可以把能量傳遞給氧，通過一系列反應導致細胞凋亡或壞死。由于納米顆粒是光敏劑的理想載體，因此將納米顆粒作為光敏劑的載體是一個非?？尚械霓k法。

本實驗研究將Photosan與空心氧化硅納米粒子結合后，對其藥物性質及效果的改善。通過設計體內、體外實驗，探討應用負載Photosan的空心氧化硅納米粒子的光動力療法對肝癌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞系HepG2購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心。實驗動物SPF級BALB/c裸小鼠，雌性，日齡26-30天，體重18-22 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。飼養(yǎng)、實驗地點在中南大學湘雅二醫(yī)院SPF級動物實驗室。

1.1.2 主要儀器 LD-630半導體激光光動力儀(中國深圳雷邁公司)光纖(中國深圳雷邁公司)超凈工作臺(中國蘇州凈化設備有限公司)恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(美國、Thermo)高速冷凍多用途離心機(美國、Beckman)倒置相差顯微鏡(日本、奧林巴斯)酶聯(lián)免疫檢測儀(美國、Thermo)流式細胞儀(美國、BD公司)搖床(中國、其林貝爾)電泳儀(中國、北京六一)水平瓊脂糖電泳槽(中國、北京六一)轉膜儀(中國、北京六一)

1.1.3 主要試劑 Photosan(Seeh of Laboratorium F＆E GmbH Wesselburenerkoog德國)中空氧化硅納米化Photosan(中南大學粉末冶金國家重點實驗室)DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)FBS(Gibco公司，美國)胰酶(四季青公司，中國)MTT(Sigma-Aldrich公司，美國)Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(Roche公司，瑞士)RIPA裂解液(北京普利萊)蛋白酶抑制劑(Merck，美國)SuperECL Plus超敏發(fā)光液(Thermo pierce，美國)顯影液，定影液(WellBiology，中國)Goat anti-rabbit IgG(Proteintech，美國)IHC二抗顯色試劑盒(KPL，美國)

2.2 方法

2.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37～42℃水浴箱中，迅速搖勻使之盡快融化，將細胞懸液注入無菌離心管中，滴加10 mL DEME細胞培養(yǎng)基，吹打混勻。1000 r/min離心5～10 min，去上清后用適當體積的10%DEME細胞培養(yǎng)基稀釋后轉入無菌培養(yǎng)瓶，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細胞生長情況，定期換液。細胞長成單層后，以胰蛋白酶消化適當后傳代。

2.2.2 MTT法測定普通 Photosan-PDT及納米化Photosan-PDT對人肝癌細胞的殺傷作用 取對數生長的細胞，倒置顯微鏡下計數，調整細胞濃度為1×105/mL，每孔200 μL接種于96孔板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。首先分兩大組，即普通光敏劑組和空心納米粒子光敏劑組。然后再分四小組，分別為完全空白對照組:既不加光敏劑，也不光照。單純光敏劑組:用不同濃度光敏劑處理細胞，不光照。單純光照組:不加光敏劑，用不同強度光照。實驗組:加不同濃度的光敏劑，用不同強度的光照。實驗組按實驗設計加入含 0、1.25、2.5、5、10、20 mg/L 濃度的光敏劑培養(yǎng)基100 μL，各組的加藥與光照間隔時間分別為1、2、4 h，在嚴格避光的條件下，置于恒溫箱中孵育，到達光照時間前，吸去光敏劑培養(yǎng)液，并用PBS洗兩遍，再加入完全培養(yǎng)基并光照，每組間隔時間分別分三塊板，分別接受2.5、5、10 J/cm2能量密度的光照，光照后繼續(xù)在恒溫箱中培養(yǎng)24 h，光敏劑實驗組按間隔時間分別去除光敏劑培養(yǎng)液，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后應用MTT法以以下公式計算細胞抑制率:細胞抑制率=1-(實驗組0D值-空白對照組OD值)/實驗對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。整個實驗操作在暗室內進行。照光前整個培養(yǎng)板用錫紙覆蓋，照光時，只照光孔揭開錫紙。相同實驗重復3次。

2.2.3 流式細胞儀檢測Photosan及納米化Photosan介導PDT對誘導細胞凋亡或壞死的影響 根據之前MTT實驗的結果，本實驗共分為4組:A組(完全空白對照組)、B組(納米化Photosan使用自身最佳作用參數PDT組)、C組(Photosan使用納米化Photosan最佳作用參數PDT組)、D組(Photosan使用自身最佳作用參數PDT組)。準備Annexin V-FITC結合液，原液為4×，用雙蒸水將其稀釋至1×。各分組樣本予以相應的干預處理后，收集細胞。將細胞培養(yǎng)液吸出，置于一合適離心管內。用PBS洗滌貼壁細胞一次后，將PBS吸出亦置于離心管內。用0.25%胰酶(不含EDTA)消化細胞。細胞消化下來后，同樣置于上步中收集的細胞培養(yǎng)液的離心管中，然后1000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀的細胞用PBS輕輕重懸，將細胞計數。取10萬左右重懸的細胞，1000 r/min離心 5 min，棄上清，加入 195 μL Annexin V-FITC結合液(1×)輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫(20-25 ℃)下避光靜置10 min。1000 r/min離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結合液(1×)輕輕重懸細胞。加入10 μL PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光靜置。上機行流式細胞計數檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。以上實驗重復3次。

2.2.4 Western-blot檢測 Photosan 及納米化 Photosan介導PDT肝癌中凋亡蛋白Caspase-3和Caspase9表達情況 取對數生長的細胞，倒置顯微鏡下計數，調整細胞濃度為4×105/mL，每孔2 mL接種于6孔板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分三組，正常對照組(A組)、納米粒子光敏劑組(B組)和普通光敏劑組(C組)。納米粒子光敏劑組和普通光敏劑組。給予的光敏劑濃度都為5 mg/L，光照劑量為5 J/cm2，間隔時間為2 h，干預后，收集細胞，加入500 μL RIPA裂解液，在冰上，蛋白裂解30分鐘，4℃下，12000 r/min離心5 min(提前開啟離心機預冷)，將離心后的上清液分裝轉移到0.5 mL離心管中，按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)的使用說明操作，測定蛋白濃度。配膠，上清液，電泳，用15%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，再從凝膠轉移到PVDF膜，封閉。隨后，將膜與一抗一起孵育，4℃過夜。孵育結束，TBS-T洗3次，每次15 min。之后，用封閉液稀釋HRP標記的二抗，稀釋比例1∶3000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育45～60 min。孵育結束，TBS-T洗3次，每次15 min。最后，ECL顯色曝光，將曝光后的底片掃描。

2.2.5 觀察 Photosan與納米化Photosan介導的PDT治療裸鼠人肝癌移植瘤的效果 收集常規(guī)培養(yǎng)的對數生長期肝癌細胞，臺盼蘭染色證實活細胞率超過99%，PBS洗滌細胞，離心，再以PBS重懸細胞，濃度為2×106/mL。每只裸鼠予以右側腋下注入0.2 mL細胞懸液(含4×105個人肝癌 HepG2細胞)。常規(guī)飼養(yǎng)裸鼠，每隔1天觀察裸鼠成瘤情況，一般5～7天后可見裸鼠前肢皮下成瘤，成瘤后用游標卡尺測量腫瘤大小，記錄腫瘤的長徑、短徑及高。當腫瘤體積達到0.5 cm3左右時，開始分組治療。分為三組，每組15只，分別為正常對照組(不加光敏劑也不光照)、納米粒子光敏劑治療組和普通光敏劑治療組，每組腹腔注射光敏劑濃度為0.2 mg/mL，注射劑量按裸鼠體重計算，為10 mg/kg。給藥4 h后予以630 nm的激光照射(500 mW，10 min)。成瘤后可見皮下移植瘤為橢球體，用橢球體積計算公式算出腫瘤體積:V=a×b×c×π×4/3(a:瘤體長徑;b:瘤體短徑;c:瘤體的高)，每組治療后每隔一天用游標卡尺測量腫瘤的大小，重復測量3次求平均值，按前述公式計算出腫瘤體積，并觀察治療前后裸鼠腫瘤生長的延遲期，以及最終生存時間。

2.2.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS統(tǒng)計學軟件行單因素方差分析處理數據。

3 結果

3.1 普通 Photosan-PDT及納米化 Photosan-PDT對人肝癌細胞的殺傷作用

在相同的光敏劑濃度及激光照射劑量的情況下，光敏劑的孵育時間不同，各組細胞存活率顯著不同;且Photosan及納米化Photosan在相同的孵育時間下，納米粒子光敏劑介導的光動力作用的細胞存活率明顯低于普通光敏劑。在5 mg/L的光敏劑濃度、10 J/cm2的光照劑量的情況下;Photosan實驗組中，在孵育時間為4 h之前，HepG2細胞存活率隨孵育時間的增加而下降;而孵育時間超過4 h后，細胞存活率與孵育4 h相比較沒有顯著差異。納米化Photosan組中，2 h的孵育時間與1 h孵育時間比較，細胞存活率有顯著差異;而孵育時間大于2 h之后，各組間的差別均無統(tǒng)計學意義(如圖1)。以上結果證實:普通光敏劑的最佳孵育時間為4 h，納米粒子光敏劑的最佳孵育時間為2 h。

圖1 Photosan及納米化Photosan孵育時間對PDT治療效果的影響(細胞存活率)

在相同的光敏劑孵育時間及激光照射劑量的情況下，光敏劑的濃度不同，各組的細胞存活率也顯著不同;且Photosan及納米化Photosan在相同的光敏劑濃度下，納米粒子光敏劑介導的光動力作用的細胞存活率明顯低于普通光敏劑。在2 h的光敏劑孵育時間、10 J/cm2的光照劑量的情況下，Photosan實驗組中，在Photosan的濃度由0 mg/L向20 mg/L遞增時，細胞存活率逐漸下降，且各組之間的差別均有統(tǒng)計學意義。當Photosan的濃度為20 mg/L時，與相同濃度的納米化Photosan組相比，細胞存活率沒有統(tǒng)計學差異。納米化Photosan組中，在光敏劑濃度低于5 mg/L時，HepG2細胞存活率隨著光敏劑濃度的增而下降;而光敏劑濃度高于5 mg/L后，細胞存活率與5 mg/L相比較沒有顯著差異(如圖2)。以上結果顯示:普通光敏劑的最佳光敏劑濃度為10 mg/L，納米粒子光敏劑的最佳光敏劑濃度為5 mg/L。

圖2 Photosan與納米化Photosan濃度對PDT殺傷效果的影響(細胞存活率)

在相同的光敏劑孵育時間及光敏劑濃度的情況下，光照劑量不同，各組的細胞存活率顯著不同;且Photosan及納米化Photosan在相同的光照劑量下，納米粒子光敏劑介導的光動力作用的細胞存活率明顯低于普通光敏劑。在2 h的光敏劑孵育時間、5 mg/L的光敏劑濃度的情況下，Photosan實驗組中，在光照劑量為2.5、5、10 J/cm2遞增時，細胞存活率逐漸下降，且各組之間的差別有統(tǒng)計學意義。納米化Photo-san組中，2.5 J/cm2與 5 J/cm2的光照劑量比較，細胞存活率有顯著差異;5 J/cm2與10 J/cm2的光照劑量比較，細胞存活率無顯著差異(如圖3)。以上結果顯示:普通光敏劑的最佳光照強度為10 J/cm2，納米粒子光敏劑的最佳光照強度為5 J/cm2。

3.2 普通 Photosan-PDT及納米化 Photosan-PDT對人肝癌細胞的凋亡影響

應用流式細胞儀定量測定普通Photosan-PDT及納米化Photosan-PDT對人肝癌細胞的凋亡發(fā)生率，結果顯示:A組、B組、C組、D組凋亡率分別為:17.14% 、80.33%、40.66%，72.33% 。治療組(B、C、D組)與對照組(A組)相比，凋亡+壞死率均有顯著差異(P＜0.05)。B組與D組之間的凋亡+壞死率比較無顯著差異(P＞0.05);而凋亡+壞死率的比較中，B組的凋亡+壞死率高于C組，且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。流式細胞計數法進一步證實了PDT對膽管癌細胞的殺傷作用及光敏劑納米化前后的效果差別。在使用相同的作用參數的情況下，Photosan介導的PDT對細胞的殺傷作用明顯低于納米化Photosan組(P＜0.05)。而使用各自的最佳作用參數的情況下，納米化Photosan組仍具有更高的細胞殺傷作用，顯著高于Photosan組(P＜0.05)(圖4)。

圖3 光照劑量對PDT治療效果的影響(細胞存活率)

圖4 A、B、C、D四組的流式細胞儀其分析：流式細胞儀中四個象限分別為左下代表正常細胞、右下代表凋亡細胞、右上代表壞死或晚期凋亡細胞、左上代表機械損傷細胞，凋亡率等于凋亡細胞+壞死或晚期的凋亡細胞/總細胞數

3.3 Photosan及納米化Photosan介導PDT肝癌中凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9表達水平

結果顯示:在5 mg/L的光敏劑濃度以及5 J/cm2的光照強度，光敏劑孵育時間間隔為3 h下，納米化Photosan處理組的標本中，激活形式的Caspase3(即Caspase320 kD)表達顯著增高(P＜0.05);而Photosan處理組的標本中激活形式的Caspase3表達亦顯著增高(P＜0.05);且納米粒子光敏劑干預組的蛋白表達顯著高于普通光敏劑干預組(P＜0.05)(如圖5)。

圖5 各組腫瘤中激活形式的Caspase-3及caspase-9蛋白表達(A：空白對照組;B：納米化Photosan處理組;C：Photosan處理組)

3.4 Photosan與納米化Photosan介導的PDT治療裸鼠人肝癌移植瘤的效果

PDT治療前，各組腫瘤體積大小無差異，在空白對照組，腫瘤生長相對較快，腫瘤種植兩周后，各組腫瘤體積達到(0.5 ±0.03)cm3，此時開始干預，在納米化光敏劑組，光動力治療后1-2天，腫瘤組織出現(xiàn)明顯的壞死，腫瘤體積迅速開始縮小，創(chuàng)面出組織再生結痂，在6-8天時，創(chuàng)面結的痂脫落，腫瘤重新長出，但相對于對照組及Photosan組腫瘤明顯要小，且生長緩慢。Photosan介導的PDT治療組，經PDT治療后初期與納米化Photosan組的治療效果類似，鼠腫瘤同樣發(fā)生嚴重的壞死反應;之后壞死組織脫落，創(chuàng)面結痂，而腫瘤的復發(fā)較早，且相對于納米化Photosan組來說腫瘤體積要大，且生長更迅速。治療后第2天起，直到實驗結束，納米化Photosan組和Photosan組的腫瘤體積均顯著小于對照組(P＜0.05)。而納米化Photosan組和Photosan組之間的腫瘤體積比較，治療后6天之前無差異，第6天之后直到實驗結束均可見前者腫瘤體積顯著小于后者，有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)(見表1，圖6)。

表1 裸鼠皮下移植瘤體積(cm3)

在對照組，腫瘤體積的生長達到2 cm3需要(21±2)天，同樣的是，在普通光敏劑組，腫瘤生長到同樣的體積需要(32±3)天，與對照組腫瘤相比延遲(9±0.3)天，納米粒子光敏劑組需要56天，與對照組腫瘤相比延遲35±0.34天。在普通光敏劑組和納米粒子光敏劑組，腫瘤的生長延遲有明顯的差異(P＜0.05)。另外，在研究裸鼠經兩種光敏劑干預治療后，兩組的裸鼠的生存期存在明顯差異，30%的裸鼠在種植腫瘤80天后仍然存活，而普通光敏劑組的裸鼠80天后基本全都死亡。對照組的裸鼠平均生存期為35天，明顯短于普通光敏劑和納米粒子光敏劑組的裸鼠平均生存期，且納米粒子光敏劑組的平均生存期要長于普通光敏劑組，分別為49天和71天，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。這些結果與腫瘤生長的延遲觀察結果是一致的。

圖6 腫瘤體積(cm3)的生長趨勢

在對照組，腫瘤體積的生長達到2 cm3需要(21±2)天，同樣的是，在普通光敏劑組，腫瘤生長到同樣的體積需要(32±3)天，與對照組腫瘤相比延遲(9±0.3)天，納米粒子光敏劑組需要56天，與對照組腫瘤相比延遲(35±0.34)天。在普通光敏劑組和納米粒子光敏劑組，腫瘤的生長延遲有明顯的差異(P＜0.05)。另外，在研究裸鼠經兩種光敏劑干預治療后，兩組的裸鼠的生存期存在明顯差異，30%的裸鼠在種植腫瘤80天后仍然存活，而普通光敏劑組的裸鼠80天后基本全都死亡。對照組的裸鼠平均生存期為35天，明顯短于普通光敏劑和納米粒子光敏劑組的裸鼠平均生存期，且納米粒子光敏劑組的平均生存期要長于普通光敏劑組，分別為49天和71天，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。這些結果與腫瘤生長的延遲觀察結果是一致的。

4 討論

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管手術切除及肝移植治療可以明顯延長肝癌病人的生存期，但是由于疾病發(fā)現(xiàn)時多屬晚期，無法行手術治療。因此，非手術治療在原發(fā)性肝癌的治療中起著舉足輕重的作用，然而原發(fā)性肝癌的非手術治療，總的來說療效仍非常有限［7］。因此對肝癌診治新技術、新療法的研究尤為重要和迫切［8］。

光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)是自20世紀80年代興起的一種治療腫瘤的新方法，其基本原理是光敏劑能被選擇性的攝取并儲留于腫瘤組織，在一定波長的光照激發(fā)下產生有細胞毒作用的一單態(tài)氧或氧自由基，毒殺腫瘤細胞，破壞腫瘤血管，激發(fā)機體免疫調節(jié)，導致腫瘤壞死、脫落，達到治療目的［9-11］。

PDT涉及到激光和光敏藥物(光敏劑)。特別是光敏劑，它(或其代謝產物)在適當波長光的激發(fā)下能產生光動力效應而破壞靶細胞。PDT的提出、發(fā)展及應用都是隨著光敏劑的發(fā)展而逐漸完善的。但是目前為止，文獻提及的大多數光敏劑都有一些弊端:主要是其疏水性或者說由于在水中的溶解度有限，導致其在液體中(例如血液中)積聚，影響其光化學特性，降低了單線態(tài)氧等的產量等，從而影響了治療效果。然而近年來納米藥物的研究進展為解決此問題提供了途徑。盡管人們已研發(fā)出多種能運載光敏劑的納米藥物載體，如脂質體(liposomes)［12，13］、多聚物載體(Polymer carrier)［14］、聚氧乙烯蓖麻油乳化液(Cremophor emulsion)［15］，微球(Microspheres)和納米粒子(Nanoparticles)［16］，均能改善光敏劑的屬性，但是他們均需要一個將裝載的藥物釋放出來的過程。這將會減慢腫瘤細胞吸收光敏劑的速率，延長光敏劑達到有效藥物濃度所需的時間［17］。所以，如果有一種納米載體不需要釋放所裝載的光敏劑的過程，那么將大大提高光敏劑的藥物效果，縮短光敏劑到達有效藥物濃度所需的時間。近來，氧化硅納米粒子因其形狀和大小可控性高、水溶性好、性質穩(wěn)定、生物相容度高等優(yōu)勢，已經引起了人們越來越多的重視。更為重要的是，氧化硅硅納米粒子對于單態(tài)氧這種小分子來說是可穿透的［18，19］，而單態(tài)氧正是PDT中關鍵的效應分子。故使用氧化硅納米粒子來裝載光敏劑，與其它傳統(tǒng)的需要釋放出裝載的光敏劑的納米載體相比，具有明顯的優(yōu)勢［20］。所以，氧化硅納米粒子是一種可提高光敏劑的光動力效應的理想的納米載體。

在本部分的體外細胞實驗中，我們首先用MTT實驗驗證了Photosan及納米化Photosan介導的PDT對肝癌HepG2細胞的殺傷作用，并且證明了將Photosan納米化后確實能增加其殺傷效率，縮短光敏劑的孵育時間，提高PDT療效。PDT的療效在一定的范圍內與以下因素均相關:光敏劑的濃度、光敏劑的孵育時間、光照劑量。將Photosan納米化后，在同樣的治療效果的情況下，可以減少Photosan的用量、縮短孵育時間。并且納米粒子光敏劑本身在試驗中未顯示出細胞毒性。這對于將來增加光敏劑的實用性打下了基礎。

在接下來的流式細胞計數實驗中，我們進一步驗證了Photosan納米化前后介導的PDT均對肝癌細胞具有顯著的殺傷作用，并且初步確定了其各自的導致細胞死亡的途徑。Photosan與納米化Photosan介導的PDT導致細胞死亡的途徑均主要以誘導細胞凋亡為主，但納米化Photosan介導的PDT導致的壞死細胞比例較Photosan為多。在Photosan及納米化Photosan使用相同的作用參數時，后者的治療效果顯著優(yōu)于前者。而當Photosan使用更高的光敏劑濃度及更長的孵育時間的情況下，其導致細胞死亡的比例仍然顯著低于納米化Photosan組。

另外，在體內實驗中，我們通過追蹤種植肝癌裸鼠模型在兩種不同光敏劑治療當中，瘤體體積的變化，腫瘤生長的延遲以及裸鼠的平均生存期，我們可以直觀看到納米粒子光敏劑治療組的效果要明顯優(yōu)于普通光敏劑組。從而證實了納米粒子光敏劑不僅在體外對腫瘤細胞殺傷效應的優(yōu)越性，還證實了納米粒子光敏劑在體內應用的可行性，為以后的臨床試驗提供了良好的動物載體實驗基礎。

我們在本文第一、二部分的試驗中，通過MTT、流式細胞技術等方法已經證實，Photosan及納米化Photosan介導的PDT對細胞的殺傷作用主要是通過誘導其凋亡和壞死。PDT引起細胞凋亡的機制主要通過兩條信號通路:1、死亡受體介導的外源性通路;2、線粒體介導的內源性通路。外源性通路在PDT誘導的細胞凋亡中并不占主導，由內源性通路激活引起的［99-100］。細胞質 Cyc與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)相結合，構成七聚凋亡復合體，與Caspase酶原-9結合，導致其裂解和激活。Caspase-9水解并活化Caspase-3/7，達到與外源性通路相同的終端。死亡受體介導的外源性通路又叫Caspase-8途徑，最終為激活Caspase-3導致細胞凋亡，兩種通路最后都是通過Caspase的活化來完成。

我們在本部分的實驗中發(fā)現(xiàn)，Photosan及納米化Photosan介導的PDT處理后，激活形式的Caspase3、Caspase9的蛋白表達水平均明顯增高，與空白對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義;并且Photosan組與納米化Photosan組之間相比，也存在統(tǒng)計學差異-后者的Caspase3、Caspase9蛋白水平的表達均較前者高。這說明Photosan及納米化Photosan介導的PDT引起腫瘤細胞凋亡通過了內源性與外源性兩種途徑，而納米化Photosan引起的這種效應更為強烈。

5 結論

綜上所述，我們通過體內外實驗探討了Photosan和納米化Photosan帶來的PDT的效果、細胞毒性及導致細胞死亡的主要途徑等。從實驗結果可得出，納米粒子光敏劑對肝癌細胞的殺傷能力高于普通光敏劑。光敏劑納米化改善了普通光敏劑的光化學效能，提高了其水溶性，增加了腫瘤組織內有效光敏藥物的濃度，從而提高腫瘤細胞的光動力治療的效果。

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