成像質(zhì)譜在微生物代謝產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

徐玉泉

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

微生物合成的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能多樣，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。另一方面，這些代謝產(chǎn)物對于微生物自身的生長、發(fā)育以及對環(huán)境中其他相鄰微生物也會產(chǎn)生重要的影響。在微生物群落中，微生物通過代謝產(chǎn)物的交換來彼此適應(yīng)和彼此競爭，只有系統(tǒng)化全面地監(jiān)測微生物產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，如聚酮、非核糖體多肽和脂肪酸等，才有可能了解微生物代謝產(chǎn)物的本質(zhì)［1］。對于微生物代謝產(chǎn)物的研究通常采用活性跟蹤的方法，即通過從土壤、植物、海洋或極端環(huán)境樣品中分離環(huán)境微生物，在實驗室條件下發(fā)酵培養(yǎng)微生物，最后確定從培養(yǎng)物中分離得到的代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物活性。該方法和微生物產(chǎn)生這些代謝物的環(huán)境割裂開來，無法系統(tǒng)化多角度地了解微生物在菌落水平上產(chǎn)生這些代謝物的全部信息，而且很難針對那些含量少且不穩(wěn)定的微生物生物活性物質(zhì)進行研究［2］。事實上，在微生物相互作用中，往往不只是單個代謝物參與化學(xué)交流。在微生物的基因組中，含有大量的基因與合成代謝產(chǎn)物相關(guān)，這些代謝物分子常常參與微生物之間的代謝交流，進而影響或控制微生物種內(nèi)和種間代謝物的合成、表型的變化以及發(fā)育分化等生物進程［3，4］?？梢姡环N微生物能夠產(chǎn)生多種活性化合物，這些化合物都有可能改變自身和相鄰微生物的生理特點。針對復(fù)雜的微生物代謝研究，成像質(zhì)譜技術(shù)顯示出較強的應(yīng)用優(yōu)勢。

1 成像質(zhì)譜的工作流程

基質(zhì)輔助激光解吸/電離成像質(zhì)譜 (matrixassisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry，MALDI IMS)可以有效地研究不需要標記的多種生物分子，如多肽、蛋白質(zhì)、聚合物和脂類在空間上的分布，一次實驗就可以檢測和可視化觀察到多個目標分子［5，6］。其基本原理為:通過控制固定有樣品的MALDI金屬板在橫向和縱向的移動，使MALDI激光將預(yù)先設(shè)定檢測點的樣品離子化，通過收集100到1 000個點的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，繪制出所測樣品二維質(zhì)譜分布圖。

圖1 成像質(zhì)譜研究微生物代謝產(chǎn)物的工作流程［1，7］Fig.1 Workflow of microbial metabolites research by MALDI-IMS［1，7］.

成像質(zhì)譜技術(shù)起初被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如病理學(xué)和藥學(xué)研究。近年來逐漸成為研究微生物代謝產(chǎn) 物 的 重 要 工 具［1，7］，其 主 要 的 工 作 流 程(見圖1，彩圖見227頁圖版)為:微生物在薄層瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)后(1)，將分析區(qū)域的微生物連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移到MALDI金屬板上，照相后覆蓋基質(zhì)(2，7，8)，在37℃脫水干燥，使瓊脂培養(yǎng)基和微生物菌落固定在MALDI板上(3)。隨后，樣品被送入MALDI成像質(zhì)譜儀中，設(shè)定微生物菌落周圍需分析的由一系列微米距離激光點組成的光柵網(wǎng)格。通過收集和處理光柵網(wǎng)格中每個激光點的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，得到每個光柵網(wǎng)格的平均質(zhì)譜。成像質(zhì)譜的最后步驟是將任何相同質(zhì)荷比(m/z)的離子設(shè)定為一種顏色來標明其在所檢測樣品上的位置(4，5，6)，和分析區(qū)域的數(shù)碼照片疊加后，產(chǎn)生可視化的生物分子在樣品中的空間分布(9)。

2 成像質(zhì)譜在微生物代謝產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

成像質(zhì)譜可以直接可視化觀察薄層瓊脂培養(yǎng)基上微生物代謝產(chǎn)物的時空分布和不同微生物之間代謝產(chǎn)物的對話。具有所需樣品少、不需預(yù)處理、能夠同時觀察多種代謝分子等優(yōu)點，可以用于發(fā)現(xiàn)新型微生物天然產(chǎn)物，指導(dǎo)天然產(chǎn)物的分離，可視化研究微生物之間的化學(xué)交流，以及闡明微生物耐抗生素新機制等。

2.1 發(fā)現(xiàn)和指導(dǎo)重要代謝產(chǎn)物的分離

海綿和藍藻能夠合成多種次生代謝產(chǎn)物，是藥用天然產(chǎn)物的重要資源［8，9］。利用成像質(zhì)譜不僅能夠從海洋藍藻中觀察到多種代謝產(chǎn)物的空間分布，而且可以從混合樣品中觀察到單個海綿絲狀體合成的代謝產(chǎn)物，證明該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)合成目標代謝產(chǎn)物的微生物以及跟蹤生物合成的進程［10］。到目前為止，成像質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于包括嗜熱和嗜溫菌、藍藻、海洋和陸地放線菌，以及致病細菌等不同環(huán)境的微生物，從中發(fā)現(xiàn)了大量已知和未知的天然產(chǎn)物，與分離提取、串聯(lián)質(zhì)譜、傅里葉變換離子回旋加速器質(zhì)譜(FT-ICR-MS)以及MALDI TOF/TOF相結(jié)合，部分或完全地確定了這些代謝物的結(jié)構(gòu)，如白僵菌產(chǎn)生的白僵菌素和白僵菌環(huán)四肽等代謝物［1］;以成像質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從放線菌中也發(fā)現(xiàn)了一些重要的多肽代謝產(chǎn)物，與基因組挖掘技術(shù)相結(jié)合，闡明了包括玫瑰孢鏈霉菌中脂糖肽類抗生素arylomycin在內(nèi)的多種多肽代謝物的生物合成途徑［11，12］。以上研究表明成像質(zhì)譜已成為發(fā)現(xiàn)微生物重要活性多肽代謝物的新平臺。

2.2 可視化研究微生物之間的化學(xué)對話

包括信號分子和營養(yǎng)物質(zhì)在內(nèi)的代謝物交換在所有生物系統(tǒng)中是一種普遍的現(xiàn)象。細菌通過產(chǎn)生各種信號分子來控制微生物種內(nèi)和種間代謝物的合成、表型的變化以及發(fā)育分化等生物進程?？莶菅堪麠U菌具有復(fù)雜的生命周期，使其能夠在諸如土壤、傷口以及腸道各種環(huán)境中生存［13］。和這些能力相符的是，枯草芽胞桿菌10%的基因組與合成特異的分子有關(guān)［3］，這些分子常常參與種內(nèi)和種間的代謝交換。枯草芽胞桿菌存在細胞自食現(xiàn)象，即在營養(yǎng)缺乏情況下，有的細胞能夠產(chǎn)生微量信號分子 SKF(sporulation killing factor)和 SDP(sporulation delaying protein)，可以通過殺死不產(chǎn)生SKF和SDP的細胞，從死亡細胞中獲取產(chǎn)生孢子的營養(yǎng)和能量來保持其物種生存［14］。由于這兩個信號分子在細胞中的含量很低，傳統(tǒng)的技術(shù)手段難以分離鑒定，無法進一步探究這兩種信號分子的結(jié)構(gòu)及其作用機制。借助成像質(zhì)譜技術(shù)，觀察到SKF和SDP信號分子并確定了它們的結(jié)構(gòu)(見圖2，彩圖見228頁圖版)，同時證明了在固體培養(yǎng)基上，SKF和SDP都能抑制枯草芽胞桿菌的生長;而在液體培養(yǎng)基中，只有SDP具有抑制作用［15］。

圖2 枯草芽胞桿菌SKF和SDP在菌落上的分布及結(jié)構(gòu)［15］Fig.2 The distribution and the structures of SKF and SDP［15］.

在生態(tài)環(huán)境中，微生物往往感應(yīng)自身或周圍的化學(xué)物質(zhì)，通過和這些化學(xué)物質(zhì)的相互作用，進而影響自身表現(xiàn)型，微生物表現(xiàn)型的改變反過來又會合成新的代謝產(chǎn)物影響周圍的環(huán)境和其他的微生物［2，16］。成像質(zhì)譜可以原位地研究環(huán)境和微生物的化學(xué)交流過程，能夠可視化地將微生物的表現(xiàn)型改變以及肉眼看不見的化學(xué)型變化與代謝物的相互作用連接在一起，動態(tài)地研究群體中微生物之間的相互作用。當枯草芽胞桿菌和天藍色鏈霉菌相鄰培養(yǎng)時，利用成像質(zhì)譜觀察到枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的脂多肽surfactin能夠抑制天藍色鏈霉菌疏水多肽SapB的合成，進而導(dǎo)致天藍色鏈霉菌不能產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，同時還發(fā)現(xiàn)surfactin對天藍色鏈霉菌抗生素CDA的合成具有抑制作用［17］;在海洋沉積樣品的微生物群體中，面對枯草芽胞桿菌的威脅，原小單胞菌首先產(chǎn)生小分子多肽(m/z 2869)抑制枯草芽孢桿菌，隨著枯草芽胞桿菌的靠近，可誘導(dǎo)原小單胞菌產(chǎn)生鉗鐵化合物promicroferrioxamine，競爭環(huán)境中的鐵元素，用于自身的生存所需［18］。

2.3 闡明微生物耐抗生素新機制

很多微生物向環(huán)境中分泌天然產(chǎn)物以阻止競爭微生物的生長發(fā)育，相反，競爭微生物會產(chǎn)生或獲得某種抗性來削弱或消除拮抗分子的作用［19］。利用成像質(zhì)譜，通過跟蹤枯草芽胞桿菌和鏈霉菌Mg1的代謝物交流(見圖3，彩圖見228頁圖版)，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌Mg1能夠水解枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的環(huán)化脂多肽surfactin(1047)，使其不能抑制自身氣生菌絲的產(chǎn)生。以此為線索，進一步發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌Mg1的水解酶SfhA能夠?qū)⒖莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的環(huán)狀surfactin水解為線性的surfactin(1065)，使其失去抑制鏈霉菌產(chǎn)生氣生菌絲的能力［20］。該結(jié)果說明在研究微生物相互作用中，成像質(zhì)譜可以追蹤天然產(chǎn)物修飾的過程。

圖3 鏈霉菌Mg1和枯草芽胞桿菌3610的成像質(zhì)譜［20］Fig.1 MALDI IMS of Bacillus subtilis 3610 and Streptomyces sp.Mg1［20］.

3 展望

成像質(zhì)譜所需樣品少，能夠可視化的研究代謝產(chǎn)物在微生物菌落和環(huán)境中的時間和空間分布。該方法能夠和微生物產(chǎn)生這些代謝物的環(huán)境聯(lián)系在一起，可以系統(tǒng)化多角度地地展示微生物在菌落水平上產(chǎn)生這些代謝物的全部信息，發(fā)現(xiàn)大量已知和未知的代謝產(chǎn)物［1］。以成像質(zhì)譜數(shù)據(jù)為指導(dǎo)，利用基因組挖掘等生物信息學(xué)手段，可以闡明其中一些重要代謝物的生物合成途徑［11，12］。借助于成像質(zhì)譜，通過觀察微生物相互作用中相鄰區(qū)域或生長抑制區(qū)域的代謝分子，便于發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)或微生物抗性新機制［15，18，20］。成像質(zhì)譜不僅用于研究微生物－微生物之間的相互作用，而且也應(yīng)用于微生物－植物、微生物－昆蟲相互作用的研究［21，22］。當然，化學(xué)基質(zhì)的選擇、檢測代謝物的類型、以及培養(yǎng)基的成分等都會對成像質(zhì)譜效果產(chǎn)生影響，但是隨著成像質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展以及和其它檢測和成像技術(shù)的結(jié)合，如解吸電噴霧電離(desorption electrospray ionization，DESI)技術(shù)［23］、共聚焦顯微技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)等，成像質(zhì)譜在微生物代謝產(chǎn)物研究中將會發(fā)揮越來越重要的作用。

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