灰霉病菌抗藥位點及其分子檢測方法研究進展

張 鑫， 馬雪梅

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124

灰霉病(grey mould)是一種重要的世界性植物真菌病害，由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)侵染所致。B.cinerea屬半知菌亞門，有性態(tài)為富氏葡萄孢盤菌(Botryotinia fuckeliana(de Bary)Whetz.)，該病菌寄主范圍廣泛，危害多種蔬菜、經(jīng)濟作物、糧食作物以及觀賞性植物。據(jù)統(tǒng)計，灰葡萄孢已被列為世界十大真菌病害之一［1］。目前對灰霉病主要以化學(xué)防治為主，包括苯并咪唑類(benzimidazoles)、N-苯氨基甲酸酯類(phellylcarbaliates)、二甲酰亞胺類(dicarboximides)、甾醇生物合成抑制劑類(sterol biosynthesis inhibitors，SBIs)、醌氧化抑制劑類(quinone oxidation inhibitors，QoIs)、琥珀酸脫氫酶抑制劑類(succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs)、苯氨基嘧啶類(anilinopyrimidines)和吡咯類(pyrroles)等，但自從使用殺菌劑以來，關(guān)于灰葡萄孢對不同作用機制的殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報道不斷出現(xiàn)，且具有新作用機制的殺菌劑開發(fā)緩慢，使化學(xué)類殺菌劑的藥效面臨挑戰(zhàn)，導(dǎo)致無法有效控制灰霉病的發(fā)生。因此，利用分子生物學(xué)方法及早發(fā)現(xiàn)并檢測抗藥菌株的出現(xiàn)，對于灰霉病的防治工作具有重要意義，本文就近年來已研究報道的灰霉病菌抗藥位點進行了總結(jié)，并對其分子檢測方法進行簡要綜述。

1 抗藥位點概述

灰霉病菌(B.cinerea)被殺菌劑抗性行動委員會(Fungicide Resistance Action Committee，F(xiàn)RAC)認(rèn)定為具有高風(fēng)險的病原真菌［2］，其抗藥菌株的出現(xiàn)頻率也很高，近年來已報道的與灰葡萄孢殺菌劑抗性相關(guān)的主要突變位點如表1所示。

表1 灰葡萄孢抗藥位點Table 1 Resistant mutations to fungicides in B.cinerea.

2 分子檢測方法

傳統(tǒng)真菌殺菌劑抗藥性檢測方法(菌絲生長法和孢子萌發(fā)法)檢測周期長，耗時耗力，檢出率低，對于抗性頻率小于1%的抗藥菌很難檢出，且對一些離體培養(yǎng)困難的病原菌檢測很難。此時，分子檢測方法就顯示出了很大的優(yōu)越性，其簡單、迅速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點越來越受到廣大科研工作者的青睞，如下是目前灰霉病菌抗藥位點的主要分子檢測方法。

2.1 測序法

隨著DNA測序的自動化及成本的不斷降低，測序法越來越多的被應(yīng)用于殺菌劑抗藥突變位點的研究［13～16］，是確定抗藥位點及類型的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法主要是通過對不同個體菌株的同一個基因或者基因片段進行PCR擴增，測序后比對基因序列，從而找出變異的堿基?；颐共【鷮BIs類殺菌劑環(huán)酰菌胺(fenhexamid)、SDHIs類殺菌劑啶酰菌胺(boscalid)［17］、二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲(iprodione)［18，19］等的抗藥分子機制的研究中均采用過測序法。測序法直觀準(zhǔn)確，可檢測未知的突變位點并做到精確定位，國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)常采用直接測序法或者結(jié)合其他方法檢測基因變異。但該方法工作量大，耗時耗力，對于大批量抗藥菌株的研究則不太適合。

2.2 切割擴增多態(tài)性標(biāo)記法(CAPS)

切割擴增多態(tài)性(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)又稱限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)，是檢測點突變的常用方法［20，21］。CAPS的檢測原理是基于單堿基突變導(dǎo)致的抗藥性菌株獲得或喪失某些限制性酶切位點，與敏感菌株相比，用限制性內(nèi)切酶酶切得到的目的片段大小不一，以此來區(qū)分敏感性和抗藥性菌株。

灰霉病菌線粒體細(xì)胞色素b基因(cytochrome b，cytb)G143A位點的突變是病原菌對QoIs類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的根本原因［17］。2012年，De Miccolis等［2］在對抗 QoIs類殺菌劑肟菌酯(trifloxystrobin)的分子機制的研究中，采用CAPS方法對細(xì)胞色素b基因(cytb)進行分子檢測。由于cytb第143位密碼子GGT到GCT的改變導(dǎo)致核酸序列產(chǎn)生了一個AluI(5'-AG↓CT-3')的酶切位點，設(shè)計特異性引物擴增包含變異位點在內(nèi)cytb基因片段，然后選用限制性內(nèi)切酶AluI對PCR產(chǎn)物進行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳即可將39株灰霉病菌野生型、69株抗藥突變體完全區(qū)分開。另外，在柑橘和草莓灰霉病菌對QoIs類殺菌劑醚菌酯(kresoxim-methyl)和嘧菌酯(azoxystrobin)的抗藥性分子機制的研究中也采用了CAPS的方法［22］。

該方法的優(yōu)點是操作簡單，無需昂貴儀器，但只能做到定性檢測，無法定量，且并不是所有突變位點處都有限制酶酶切位點的變化，因此該方法具有一定的局限性。如果酶切反應(yīng)不完全會影響結(jié)果的判斷，故經(jīng)常與測序法同時使用。

2.3 擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)

擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)別名很多，又稱 AS-PCR(allele specific PCR)［23，24］、ASA(allele-specific amplification)、PASA(PCR amplifications of specific alleles)和MAMA(mismatch amplification mutation assay)。其基本原理為:Taq DNA聚合酶由于缺少3'→5'外切酶活性，引物3'末端堿基錯配會導(dǎo)致PCR產(chǎn)物急劇減少，以此針對野生型和突變型基因設(shè)計3條引物，其中2條引物的3'末端分別與正常堿基或者突變堿基匹配，第3條引物為另一側(cè)通用引物，含正常堿基的引物對只能擴增獲得野生型菌株的基因片段，而抗藥菌株的基因片段無法獲得，同理，含突變堿基的引物對只能對抗藥菌株進行擴增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)即可區(qū)分突變型與野生型基因。

灰霉病菌琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白亞基(succinate dehydrogenase iron-sulfurprotein subunit，SdhB)H272Y或H272R處突變是抗SDHIs類殺菌劑的主要原因。2011年，Yin等［25］在針對抗SDHIs類殺菌劑啶酰菌胺(boscalid)的蘋果灰霉病菌SdhB基因的H272Y和H272R突變位點進行檢測時，設(shè)計了一條通用上游引物272Y/R-F，兩條等位基因特異性下游引物。針對H272Y突變類型，第272位密碼子由CAC(BosS)變?yōu)門AC(BosR)，其中一條下游引物272Y-R的3'末端堿基為A，與突變堿基T互補;同理，針對H272R突變類型(CAC→CGC)，另一條等位基因特異引物272R-R的3'末端堿基為C，與突變堿基G互補。采用272Y/R-F+272Y-R，272Y/R-F+272R-R引物對分別檢測66株boscalid抗性菌株(BosR)和106株boscalid敏感菌株(BosS)，其中65株抗藥菌擴增得到了232 bp的目的片段，而106株敏感菌株和1株抗藥菌株未獲得相應(yīng)條帶，后經(jīng)測序表明這1株抗藥菌株屬于另外一種突變類型(P225F)。由此可見，采用AS-PCR的方法可準(zhǔn)確檢測包含H272Y或者H272R突變位點的灰霉病菌抗藥菌株。此外，作者在1個PCR反應(yīng)中加入了3條引物(272Y/R-F，272Y-R和272R-R)，此多重AS-PCR的方法可同時檢測H272Y型和H272R型突變。

采用 AS-PCR 的方法，Bardas等［24］以及 Yin等［26］在對抗 QoIs類殺菌劑唑菌胺酯(pyraclostrobin)的奇異果灰霉病菌、蘋果灰霉病菌cyt b基因進行分子檢測時，成功檢測出G143A型突變。該方法的缺點是容易出現(xiàn)非特異性擴增導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。

2.4 四引物擴增阻滯突變系統(tǒng)(Tetra primer ARMS-PCR )

四引物擴增阻滯突變系統(tǒng)是在ARMS-PCR方法的基礎(chǔ)上衍生而來。其特點是在突變堿基兩側(cè)設(shè)計兩條外引物及兩條等位基因特異性內(nèi)引物，將4條引物同時加入一個反應(yīng)體系中，PCR結(jié)束后可得到不同長度的特異性擴增片段，經(jīng)凝膠電泳分析片段有無及大小即可直接區(qū)分野生型及突變型［27］。外引物兼具反應(yīng)陽性對照及與兩條內(nèi)引物分別配對選擇性擴增突變型與野生型的作用。2009年，Munoz等［28］采用該方法對抗苯并咪唑類灰葡萄孢E198A位點進行檢測。

Tetra primer ARMS-PCR對單核苷酸突變檢測具有簡便、快速、價格低廉等優(yōu)點，但需要對引物濃度、內(nèi)外引物比例、退火溫度、Taq酶濃度等各種PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，才能保證該方法的準(zhǔn)確性和靈敏性，優(yōu)化步驟費時費力。

2.5 Real-time AS-PCR

Real-time PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料，不用進行PCR后處理或電泳檢測，可通過熒光強度變化直接進行定性和定量分析。具有操作簡便、快速、高效、高敏感性等特點。Real-time PCR已廣泛應(yīng)用于點突變檢測［29］。

Real-time AS-PCR是在AS-PCR的基礎(chǔ)上在PCR體系中加入SYBR Green熒光染料，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)的進程。在對QoIs類殺菌劑肟菌酯的抗性分子機制的研究中，Real-time AS-PCR表現(xiàn)出很高的特異性，能夠在少至0.1 ng的DNA中檢測到G143A突變，且檢測結(jié)果和CAPS及測序法得到的結(jié)果一致［2］。但該方法的一個限制因素是可能會出現(xiàn)非特異性擴增，雖然這種限制因素不會影響多態(tài)性的檢測，但會影響定量的準(zhǔn)確性，尤其是對一些低豐度突變基因的檢測。

2.6 等位基因特異性探針及引物擴增

甾醇是生物細(xì)胞膜的重要組分，SBIs類殺菌劑環(huán)酰菌胺抑制甾醇生物合成過程中的3-酮基還原酶的活性，從而影響細(xì)胞膜的功能，干擾細(xì)胞正常新陳代謝，影響菌體生長，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［30］。2012 年，Billard 等［31］采用了一種精確、高效且可準(zhǔn)確定量的等位基因特異性探針及引物擴增(allele specific probe and primer amplification assay，ASPPAA)方法檢測灰霉病菌3-酮基還原酶基因 (3-keto reductase，erg27)F412S、F412V 和F412I三種類型的突變，并對突變型與野生型混合基因組中erg27基因的不同DNA多態(tài)性進行了成功檢測，靈敏度達1%。

ASPPAA PCR的原理是:利用Taq酶5'→3'外切酶活性，將探針酶切降解，使5'報告基團(FAM)和3'淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。其特點是針對突變位點設(shè)計一條與DNA一條鏈結(jié)合的等位基因特異性引物以及與另外一條DNA鏈結(jié)合的等位基因特異性TaqMan-MGB探針，TaqMan-MGB探針的5'端連接Report基團 FAM，3'端連接 Quencher基團MGB-NFQ(minor groove binder-nonfluorescent quencher)。為減少非特異性雜交，引物和探針之間最多只能有3個核苷酸的重疊(見圖1)。為了區(qū)別erg27四種類型的等位基因，研究人員共設(shè)計了4對引物和探針，每一對組合特異針對一種類型的基因。為了提高特異性，分別在特異性引物的3'末端的3或5個堿基處人為引入一個突變，并以干擾極限值(interference limit，IL)對此方法的非特異性擴增情況進行了分析，結(jié)果表明該方法的非特異擴增現(xiàn)象基本可以忽略不計。

圖1 ASPPAA PCR原理示意圖［31］Fig.1 Principle schematic diagram of the ASPPAA PCR［31］.

相對于常用的AS real-time PCR方法而言，ASPPAA PCR由于包括引物和探針兩種特異篩選，其非特異擴增的幾率降低至少4倍，這種新的方法可用來鑒定混合DNA中復(fù)雜的SNP位點，且錯誤率小于1%。另一優(yōu)點是MGB的存在可提高探針Tm值，使高Tm值的探針的長度縮短，便于設(shè)計，尤其對富含AT序列的探針設(shè)計有很大幫助，且TaqMan-MGB探針3'端的 Quencher基團為非熒光淬滅基團(NFQ)，可大大降低熒光本底。此外，TaqMan-MGB探針可以增大配對與非配對模板間的Tm值差異，故TaqMan-MGB探針雜交的穩(wěn)定性大大提高，實驗結(jié)果更精確，分辨率更高。但此方法前期需要進行引物及探針的優(yōu)化，耗費時間較長，成本較高。

2.7 雙雜交探針法(又稱LightCycler技術(shù))

灰霉病菌抗苯并咪唑類殺菌劑的主要分子機制是由于198位或200位氨基酸發(fā)生改變。2008年，Banno等［3］通過熒光雜交探針和熔解曲線分析，建立了一種快速檢測抗藥突變位點的Realtime PCR法。針對苯并咪唑類抗藥菌的突變位點E198A、E198K、E198V和F200Y設(shè)計了一對引物TUB-HPF1和TUB-HPR1，其224 bp的擴增產(chǎn)物中包含198位及200位密碼子。另外設(shè)計兩個探針，其中sensor probe(TUB-U27198-Sn)可以和包含突變位點的區(qū)域雜交，其3'末端標(biāo)記有供體熒光基團熒光黃(fluorescein)，另一個 anchor probe(TUB-U27198-An)的5'末端標(biāo)記有受體熒光基團LC-Red 640，當(dāng)兩個探針和PCR產(chǎn)物中的目的序列雜交時，兩個基團相互靠近發(fā)生熒光共振能量傳遞，在LightCycler儀器上進行實時PCR和熔解曲線分析，熔解峰對應(yīng)的溫度與 sensor probe和PCR產(chǎn)物間的同源性相關(guān)，且不同位置的堿基突變或同一位置的不同堿基的變化都會影響雜交的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，攜帶有 E198A(GAG→GCG)、野生型、E198K(GAG→AAG)、F200Y(TTC→TAC)的BenA基因的不同變化，導(dǎo)致 sensor probe 分別在 68.7℃、62.0℃、59.4℃和57.2℃產(chǎn)生可辨的熔解峰，由此即可判斷突變類型。在BenA基因的檢測過程中，在63.4℃出現(xiàn)了一個未知的熔解峰，經(jīng)測序分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的突變類型E198V(GAG→GTG);編碼組氨酸激酶的BcOS1基因突變導(dǎo)致灰葡萄孢對二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性［6，32］。Banno 等［3］采用該方法對BcOS1基因的三種突變類型也進行了成功檢測，包括I365S(ATC→AGC)、V368F(GTC→TTC)+Q369H(CAG→CAC)和 Q369P(CAG→CCG)。

這些數(shù)據(jù)顯示，基于Real-time PCR的雜交探針技術(shù)，只要探針設(shè)計合適，僅利用一對探針和一對引物即可對苯并咪唑類殺菌劑的多種突變位點進行檢測，且同樣適用于對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥位點的研究。另外，在研究抗QoIs類殺菌劑灰葡萄孢菌株的G143A位點中同樣采用了該方法［33］。

相比PCR-RFLP和AS-PCR，雙雜交探針法可在一個反應(yīng)內(nèi)對多種突變類型進行檢測，無需后續(xù)任何操作，如限制酶酶切和凝膠電泳，且可檢測未知的突變類型。但該方法需要昂貴的儀器及兩個探針的合成，成本較高，且如果探針設(shè)計不合適，對檢測結(jié)果的影響會非常明顯，Banno設(shè)計的sensor probe與BenA E198A基因完全匹配，產(chǎn)生了可辨的熔解峰，而采用與野生型序列完全匹配的sensor probe則未得到可辨的熔解曲線［3］，由此可見，探針設(shè)計至關(guān)重要，直接影響結(jié)果的判讀，由此也為試驗設(shè)計帶來較大困難。

3 展望

灰霉病菌針對六大類殺菌劑的抗藥性分子機制已被報道，包括:苯并咪唑類、N-苯氨基甲酸酯類、二甲酰亞胺類、SBIs、SDHIs和 QoIs，本文總結(jié)了與抗藥性相關(guān)的主要突變位點，共涉及5個基因。隨著將來研究的深入，并不排除與抗藥性有關(guān)的其他突變位點的存在。

目前，有多種分子檢測方法應(yīng)用于灰霉病菌抗藥位點檢測的研究中，每個方法各有利弊。對于已知靶基因中的未知突變類型的檢測只有測序法及雙雜交探針法。除了Real-time AS PCR、ASPPAA以及雙雜交探針法外，其他方法只能做到定性研究。并且目前的方法只能對每個突變位點進行分別檢測或者對同一靶基因不同變異堿基進行檢測，不能同時分析對多個靶基因的不同變異位點。

當(dāng)前迫切需要一種快速、簡便、高通量的檢測方法，如果能找到一種同時檢測多種類型殺菌劑抗藥菌株方法，對于灰霉病菌抗藥性的早期監(jiān)測將具有重大意義。

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