幾種基于PCR的分子標(biāo)記在甘薯遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

何虎翼， 譚冠寧， 何新民， 何海旺， 李麗淑， 唐洲萍， 王 暉

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，南寧530007

廣義上來說，遺傳多樣性是指種內(nèi)或種間表現(xiàn)在分子、細(xì)胞、個(gè)體三個(gè)水平的遺傳變異度。在研究甘薯遺傳多樣性時(shí)，多采用其狹義上的含義，即指種內(nèi)不同群體和個(gè)體間的遺傳多態(tài)性程度。遺傳多樣性是維持生物繁殖活力、抗病蟲害能力和適應(yīng)環(huán)境變化的基礎(chǔ)，也是人類改良和創(chuàng)造新栽培植物的源泉。為了分析植物遺傳多樣性，人們已經(jīng)從形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平、生化水平和分子水平進(jìn)行了深入研究。由于DNA分子標(biāo)記具有數(shù)量極大、不受環(huán)境及基因表達(dá)與否限制、利于隱性性狀選擇、不影響目標(biāo)性狀表現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已在遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用。

雙子葉植物甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)屬旋花科甘薯屬，是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和新型能源作物。甘薯在中國(guó)已有400多年栽培歷史，種植面積占世界的65.4%，產(chǎn)量占85.9%。在目前育成的甘薯品種中，約94%具有南瑞苕和沖繩100號(hào)的血緣，遺傳基礎(chǔ)相當(dāng)狹窄，嚴(yán)重影響新品種選育工作。雖然已經(jīng)保存了近600份甘薯地方品種，但這些地方品種的遺傳多樣性沒有明確。在分析地方品種遺傳多樣性基礎(chǔ)上拓寬育種材料的遺傳背景，有助于優(yōu)良親本的選擇和輔助育種，對(duì)甘薯品種遺傳改良具有重要意義。

1 分子標(biāo)記技術(shù)概述

DNA分子標(biāo)記技術(shù)研究始于19世紀(jì)80年代，現(xiàn)有的分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種。由于甘薯染色體數(shù)目多且小，存在自交不親和及同一不育群體內(nèi)品種間雜交不親和問題，其遺傳背景復(fù)雜，農(nóng)藝性狀的觀察和分析難以真實(shí)反映其親緣關(guān)系，而DNA分子標(biāo)記不受環(huán)境影響，穩(wěn)定性好，已經(jīng)成為甘薯種質(zhì)資源研究的重要手段。目前在甘薯育種研究中主要采用以PCR擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的RAPD、AFLP和ISSR標(biāo)記。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是以10 bp左右的隨機(jī)引物通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離、染色來顯示擴(kuò)增 DNA片段多態(tài)性［1］。RAPD標(biāo)記不依賴于種屬的特異性，操作簡(jiǎn)單，成本較低，DNA樣品用量少，復(fù)性溫度低，但難以區(qū)別純合體和雜合體，易受反應(yīng)條件影響，擴(kuò)增穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶雙酶解后，將雙鏈人工接頭連接到酶切后的片段的兩端，用帶有選擇性堿基的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性［2］。AFLP標(biāo)記多態(tài)性高，模板用量少，穩(wěn)定性好，但技術(shù)受專利保護(hù)，DNA純度和內(nèi)切酶質(zhì)量要求高。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)是根據(jù)相對(duì)保守的微衛(wèi)星DNA兩端單拷貝序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段來揭示微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性［3］。SSR標(biāo)記多態(tài)性頻率高，多為單一多等位基因位點(diǎn)，可鑒別純合和雜合基因型，重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠，DNA用量少，但引物設(shè)計(jì)是其難點(diǎn)。簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simple sequence repeats，ISSR)就是在SSR的3'端或5'端加錨1～4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基，并以此為引物，對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)電泳、染色，根據(jù)譜帶的有無及相對(duì)位置來分析樣品間的多態(tài)性［4］。ISSR標(biāo)記是共顯性，成本較低、重復(fù)性好、多態(tài)性較高，其缺點(diǎn)在于需要摸索PCR最適反應(yīng)條件，不能用來區(qū)分純合和雜合基因型。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORFs的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增［5］。SRAP標(biāo)記在基因組中均勻分布，多態(tài)性強(qiáng)，DNA用量少，效率高、共顯性、重復(fù)性好，但沒有利用擴(kuò)增區(qū)域序列的任何信息，產(chǎn)生的標(biāo)記隨機(jī)分布在染色體上。上述均為基于PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)，DNA用量均在0.2 g左右，各自特點(diǎn)對(duì)比見表1。

表1 幾種基于PCR的DNA分子標(biāo)記技術(shù)的比較Table 1 Comparison of several PCR-based DNA molecular markers.

2 遺傳差異分析

在甘薯育種中，為了有效利用優(yōu)異種質(zhì)資源，必須首先對(duì)甘薯種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。隨著DNA分子標(biāo)記的迅速發(fā)展，各種分子標(biāo)記技術(shù)都已應(yīng)用于甘薯遺傳多樣性分析中(見表2)。

2.1 甘薯地方品種與主要育成品種的遺傳差異分析

李強(qiáng)等［12］用10對(duì) AFLP引物和17條 ISSR引物對(duì)26份中國(guó)甘薯主要育成品種進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)中國(guó)甘薯主要育成品種間遺傳相似度高，南方薯區(qū)品種遺傳差異高于北方薯區(qū)和長(zhǎng)江中下游薯區(qū)，通過加強(qiáng)不同薯區(qū)育種親本交換可以逐步改變中國(guó)育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄現(xiàn)狀。張超凡等［16］利用12對(duì)SSR引物對(duì)31份湖南甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)每對(duì)引物可獲得6個(gè)等位基因位點(diǎn)，因此，湖南甘薯品種遺傳多樣性較豐富。宋吉軒等［21］利用7個(gè)ISSR引物對(duì)收集的45份貴州甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)它們之間親緣關(guān)系較近。

表2 甘薯遺傳多樣性的相關(guān)報(bào)道Table 2 The related reports of sweet potato genetic diversity.

2.2 我國(guó)甘薯種質(zhì)資源保存與多樣性分析

利用20對(duì)SSR引物對(duì)24份甘薯材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，趙冬蘭等［17］發(fā)現(xiàn)離體保存5年和8年的效果相同，我國(guó)保存的甘薯種質(zhì)資源還是較豐富的。羅文彬等［22］利用15個(gè)ISSR引物檢測(cè)34份甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，并劃分為4大類，明確了所保存的甘薯種質(zhì)資源的遺傳背景。為了解不同用途甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，陳新起等［23］利用11個(gè)ISSR引物對(duì)10個(gè)菜用甘薯材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，顯示菜用甘薯材料遺傳差異較大，為菜用甘薯雜交親本選配提供依據(jù)。黃潔等［24］利用17對(duì) ISSR引物對(duì)21份紫肉、28份紅黃肉甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)紫薯和紅黃薯具有不同的來源，同一育種單位的品種親緣關(guān)系較近。

2.3 甘薯的起源與進(jìn)化研究

賀學(xué)勤等［6］用30個(gè)RAPD引物、9對(duì) AFLP引物和14個(gè)ISSR引物對(duì)來自安徽、福建、河南和廣東的48個(gè)甘薯地方品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，揭示中國(guó)是甘薯的次生多樣性中心，作為最早引入地，廣東的地方品種遺傳變異高，可重點(diǎn)加以利用。利用AFLP標(biāo)記技術(shù)，Zhang等［14］對(duì)來自拉丁美洲4個(gè)不同地理區(qū)域的馬鈴薯品種開展遺傳多樣性分析，結(jié)果表明中美洲是甘薯多樣性的第一中心，秘魯－厄瓜多爾被認(rèn)為是甘薯多樣性的第二中心。Huang和Sun［25］對(duì)40個(gè)番薯屬植物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高多態(tài)性ISSR標(biāo)記能更好地實(shí)現(xiàn)種內(nèi)分離，進(jìn)而推斷出Ipomoea triloba是甘薯的祖先之一。在育種中，常需要將栽培種與野生種進(jìn)行差異比較。Hu等［26］用8個(gè)ISSR引物評(píng)估34個(gè)甘薯栽培種或野生種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，認(rèn)為ISSR標(biāo)記適合于栽培甘薯和野生種的指紋分析，可用于構(gòu)建甘薯連鎖圖譜。

2.4 甘薯品種的地域差異分析

Liu等［13］利用AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)主要甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)遺傳變異主要存在于區(qū)域內(nèi)，區(qū)域間的變異水平非常低。但以長(zhǎng)江為分界線，北方地區(qū)和南方地區(qū)甘薯品種之間存在顯著的遺傳變異。郝玉民等［29］利用6對(duì)SRAP引物對(duì)36個(gè)甘薯品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)亞洲品種和美洲品種、近緣野生種與育成品種、中國(guó)育成品種之間有較高的遺傳相似度。李強(qiáng)等［27］用17個(gè)ISSR引物對(duì)62份甘薯主要親本材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明中國(guó)自育親本與外引親本間遺傳距離較遠(yuǎn)，在未來育種中，可以用國(guó)內(nèi)自育親本與外引親本、亞洲親本與其他外引親本配制雜交組合。

2.5 國(guó)外品種資源的遺傳多樣性分析

用引物SP20、SP06、A69和 A71檢測(cè)印度尼西亞東爪哇省12個(gè)甘薯品種的遺傳多樣性，可分成兩大類，但其中3個(gè)品種沒有擴(kuò)增條帶，無法做進(jìn)一步鑒定［7］。Moulin 等［8］用 18 個(gè) RAPD 引物和19個(gè)ISSR引物，對(duì)來自巴西里約熱內(nèi)盧農(nóng)村和當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)82個(gè)甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數(shù)分別為0.80和0.89，表明傳統(tǒng)農(nóng)戶保存甘薯品種有很好的遺傳多樣性。Elameen等［15］對(duì)97個(gè)坦桑尼亞甘薯種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示 AFLP標(biāo)記可用來檢測(cè)所收集種質(zhì)的重復(fù)性，是描述甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效工具。為了解不同地理環(huán)境條件下甘薯種質(zhì)資源親緣關(guān)系，吳覲宇等［28］利用10個(gè)ISSR引物對(duì)25份美國(guó)甘薯材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)這些材料遺傳多樣性較高，其中6-3-1、6-8-7可用于國(guó)內(nèi)甘薯育種。

3 親緣聚類分析

除用于甘薯遺傳差異分析外，分子標(biāo)記也可用于甘薯種質(zhì)親緣關(guān)系分析。在譜系親緣關(guān)系分析中，15種RAPD隨機(jī)引物可將17個(gè)甘薯品種及其近緣野生種聚類成三個(gè)類群，三裂葉野牽牛單個(gè)野生種組成A類群，B類群由四倍體和六倍體三淺裂野牽牛及12個(gè)甘薯品種組成，海濱野牽牛和二倍體三淺裂野牽牛組成C類群［9］。用26個(gè)多態(tài)性引物對(duì)中國(guó)30個(gè)甘薯主栽品種RAPD聚類分析表明，地域分布相近的甘薯品種或具有同一親本的甘薯品種聚類在一起［10］。利用RAPD分子標(biāo)記獲得的育成品種聚類結(jié)果表明，地方品種中“四季種”和“保亭種”遺傳距離最近，地方品種與中國(guó)主要育成品種遺傳距離較遠(yuǎn)，這與已知甘薯品種系譜圖吻合度較高［11］。Veasey 等［18］調(diào)查巴西圣保羅傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)家庭78個(gè)甘薯品種，SSR聚類分析表明高遺傳和品種內(nèi)多樣性。Yada等［19］用10對(duì)熒光標(biāo)記的SSR引物分析192份烏干達(dá)甘薯種質(zhì)，表明聚成的四大類沒有明顯的起源親緣關(guān)系，約190個(gè)可作為潛在的父母本基因型。吳潔等［30］利用30對(duì)SRAP引物對(duì)86份甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明這些甘薯種質(zhì)資源可分為四大類，其中四川省育成的甘薯品種遺傳范圍較狹窄。

在遺傳多樣性與性狀特征標(biāo)記方面，Koussao等［20］用28對(duì)SSR引物評(píng)估非洲布基納法索112個(gè)甘薯品種的多樣性，發(fā)現(xiàn)遺傳相似系數(shù)為0.49，與形態(tài)特征標(biāo)記之間沒有相關(guān)性。為了分析48份主要甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，張凱等［31］利用37對(duì)SRAP引物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SRAP標(biāo)記聚類結(jié)果與系譜吻合，但與依據(jù)農(nóng)藝性狀聚類結(jié)果相差較大，且種質(zhì)資源間遺傳差異與地理來源無關(guān)。

4 展望

理想的分子標(biāo)記要求具有高多態(tài)性、共顯性遺傳、均勻遍布整個(gè)基因組、成本低廉、重復(fù)性好、檢測(cè)快捷、能辨別等位基因等特點(diǎn)。通過對(duì)幾種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物開發(fā)費(fèi)用低，可以在不同物種間通用。與RAPD單引物相比，ISSR揭示的多態(tài)性百分率較高，且由于其具有較高的退火溫度、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高［32］。相對(duì)于AFLP而言，ISSR費(fèi)用較低，反應(yīng)體系具有一定的通用性，操作簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用。ISSR揭示的地區(qū)內(nèi)(間)品種間的遺傳差異水平高于RAPD和AFLP，這可能是由于在甘薯屬中存在大量的微衛(wèi)星變異造成的［33］。與SRAP相比，ISSR所用引物更少，效率更高。不同分子標(biāo)記間遺傳多樣性參數(shù)比較分析結(jié)果表明，ISSR和 SSR參數(shù)值間差異顯著，與RAPD、AFLP不宜直接比較，而RAPD和AFLP參數(shù)間可以直接比較［34］。ISSR既可以區(qū)分遺傳相似系數(shù)較近的甘薯品種資源，也能區(qū)分遺傳距離較遠(yuǎn)的甘薯種質(zhì)資源，是一種共顯性、成本較低、重復(fù)性好、多態(tài)性較高、非常有發(fā)展前途的分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用到基因組作圖和基因定位、物種親緣關(guān)系和系統(tǒng)分類、基于圖譜克隆基因和輔助育種等研究中。

對(duì)表2總結(jié)的已有研究結(jié)果做進(jìn)一步比較分析，發(fā)現(xiàn)ISSR標(biāo)記所需引物數(shù)量最少，一般為12～15條;從多態(tài)性百分率來看，RAPD最高，其次是SRAP和ISSR，AFLP最低;AFLP的遺傳相似系數(shù)變化范圍最大，ISSR次之，RAPD、SRAP和SSR相差不大;從單引物能區(qū)分的種質(zhì)資源數(shù)量來看，ISSR最多，其次是 AFLP和 SSR，SRAP最少。賀學(xué)勤等［6］分析了48個(gè)甘薯地方品種遺傳多樣性，認(rèn)為ISSR退火溫度較高，穩(wěn)定性好，在分析甘薯遺傳多樣性方面要強(qiáng)于RAPD，這與Chowdhury等［32］的結(jié)論一致。通過比較 RAPD、ISSR和AFLP三種分子標(biāo)記在檢測(cè)甘薯品種間遺傳差異上的應(yīng)用效果，賀學(xué)勤等［35］發(fā)現(xiàn)ISSR標(biāo)記估計(jì)的品種間遺傳距離大于RAPD和AFLP標(biāo)記的估計(jì)值，ISSR標(biāo)記更適于分析甘薯品種的親緣關(guān)系。通過對(duì)26份中國(guó)甘薯主要育成品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，李強(qiáng)等［12］發(fā)現(xiàn)雖然AFLP標(biāo)記引物在每個(gè)品種中擴(kuò)增條帶數(shù)平均比ISSR標(biāo)記多6條，但I(xiàn)SSR標(biāo)記擴(kuò)增多態(tài)性條帶比AFLP標(biāo)記高27.19%。Moulin等［8］對(duì)來自巴西里約熱內(nèi)盧農(nóng)村和當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)82個(gè)甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)ISSR和RAPD這兩種標(biāo)記結(jié)果有較好的一致性。雖然ISSR標(biāo)記多態(tài)性比RAPD標(biāo)記略低4.3%，但表型相關(guān)系數(shù)比RAPD標(biāo)記高出0.09。綜合考慮，ISSR標(biāo)記遺傳多態(tài)性相對(duì)較好，可以實(shí)現(xiàn)用最少的引物來區(qū)分?jǐn)?shù)量最多、遺傳距離較遠(yuǎn)的甘薯種質(zhì)資源。值得注意的是，在將ISSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于不同作物時(shí)，需要探索PCR反應(yīng)最適條件。

在上述有關(guān)甘薯研究的19篇相關(guān)文獻(xiàn)中，應(yīng)用RAPD有6篇，AFLP有5篇，SSR有5篇，ISSR有11篇，SRAP有3篇，這表明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到甘薯遺傳多樣性分析中。它不僅被用來分析國(guó)內(nèi)甘薯品種遺傳差異，也用于分析國(guó)外甘薯材料遺傳多樣性;或用于分析不同用途甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，還可用于分析不同地域甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。隨著甘薯品種改良工作的不斷推進(jìn)，為適應(yīng)甘薯品種抗多種病蟲害、用途多樣化的需求，未來分子標(biāo)記將會(huì)成為揭示甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要技術(shù)手段。由于ISSR標(biāo)記技術(shù)的廣闊應(yīng)用前景，今后我們應(yīng)該加強(qiáng)ISSR標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用研究，通過與提取程序化、電泳膠片分析自動(dòng)化、信息(數(shù)據(jù))處理計(jì)算機(jī)化相結(jié)合，開發(fā)出成本更低、分析速度更快、信息量更大的分子標(biāo)記技術(shù)，以期為遺傳多樣性研究和評(píng)估提供強(qiáng)大支持。

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