固相萃取-加壓毛細(xì)管電色譜法測(cè)定水產(chǎn)品接觸材料中五種芳香胺

羅雨陽，吳偉建，楊立業(yè)，歐陽小琨

（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022）

芳香胺（Aromatic amine）是一種重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)染料和包裝材料中，是一類被人們熟知的有毒有害物質(zhì)[1]，如苯胺可以通過吸入、食入或透過皮膚吸收而致中毒，食入0.25 mL就嚴(yán)重中毒。水產(chǎn)品中芳香胺的主要來源是與之接觸的材料，接觸材料中若存在芳香胺類物質(zhì)，就很容易在特定條件下遷移至水產(chǎn)品中，對(duì)消費(fèi)者的身體健康帶來非常大的安全隱患[2-4]。近年來，國(guó)際上對(duì)芳香胺的污染問題越來越重視，歐盟規(guī)定使用芳香族異氰酸酯為原料和偶氮染料的食品接觸材料不可釋放出芳香胺類物質(zhì)(以苯胺計(jì))，2007年頒布的新指令2007/19/EC中更新其檢出限為0.01 mg/kg(以苯胺計(jì))。目前，芳香胺遷移量的檢測(cè)技術(shù)主要為氣相色譜法[5]、離子交換色譜法[6]、高效液相色譜法[7-9]、色譜質(zhì)譜聯(lián)用[10-14]、毛細(xì)管電泳法[15-16]等。氣相色譜和高效液相色譜法靈敏度較高，對(duì)芳香胺進(jìn)行分離檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，簡(jiǎn)便易行，而色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則使檢測(cè)的靈敏度更上了一個(gè)臺(tái)階。但是由于用以上方法對(duì)芳香胺進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通常需要進(jìn)行衍生化，過程非常繁瑣，不易進(jìn)行。毛細(xì)管電色譜檢測(cè)技術(shù)則主要應(yīng)用電滲流或電滲流結(jié)合壓力流來推動(dòng)流動(dòng)相可以說是HPLC和HPCE的有機(jī)結(jié)合，它不僅克服了HPLC中壓力流本身流速不均勻引起的峰擴(kuò)展，而且柱內(nèi)無壓降，使峰擴(kuò)展只與溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)，從而獲得了接近于HPCE水平的高柱效，同時(shí)還具備了HPLC的選擇性。而國(guó)內(nèi)對(duì)毛細(xì)管電色譜法測(cè)定水產(chǎn)品接觸材料中芳香胺的含量鮮有報(bào)道。

本文建立了一種固相萃取-加壓毛細(xì)管電色譜法，測(cè)定水產(chǎn)品接觸材料中5種芳香胺類化合物含量的方法。樣品浸泡遷移后，經(jīng)固相萃取凈化富集，最后用EP-100-20/45-3-C18毛細(xì)管柱進(jìn)行分離檢測(cè)。由于結(jié)合了HPLC的分離選擇性和電滲流的推動(dòng)力，5種芳香胺能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高，可用于水產(chǎn)品接觸材料中芳香胺的快速檢測(cè)，同時(shí)也為水產(chǎn)品中芳香胺的檢測(cè)提供一種參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜儀(上海通微分析技術(shù)有限公司)，包括兩臺(tái)高壓輸液模塊，微流控模塊，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(190-800 nm)，高壓電源模塊(±30 kV范圍內(nèi))；毛細(xì)管電色譜柱EP-100-20/45-3-C18：內(nèi)徑 100 μm，有效柱長(zhǎng) 20 cm，填料粒徑 3 μm ODS；D2F6020 型真空干燥箱（寧波江南儀器廠），pH計(jì) (HORIBA公司），MTN-2800D干浴氮吹儀，ASE-12固相萃取儀，Supeleo EnviTM-Chrom P固相萃取小柱，DIKMA ProElut C18固相萃取柱，Waters OASIS HLB Cartridge柱，CHROMABOND XTR柱。水產(chǎn)品接觸材料購(gòu)于舟山水產(chǎn)品市場(chǎng)。

甲醇、乙腈為高效液相色譜級(jí)，購(gòu)置于美國(guó)Tedia公司；叔丁基甲醚、乙醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鉀均為分析純；芳香胺標(biāo)準(zhǔn)品（苯胺、2,6-二甲基苯胺、鄰甲氧基苯胺、對(duì)氯苯胺、3,3’-二甲基聯(lián)苯胺）純度>99%，購(gòu)置于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取目標(biāo)分析物各10.0 mg（精確到1 mg），使用甲醇稀釋并轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，充分混勻，得到濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃下避光保存，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5.0 mL于50 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到濃度為20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下避光保存，備用。依次稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到濃度為0.00、2.00、5.00、10.00、15.00 和 20.00 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

將水產(chǎn)品接觸材料洗凈，晾干后稱重。再將適量體積的水（不少于500 mL）倒入水產(chǎn)品接觸材料中，密封后放入90℃水浴內(nèi)，1 h后取出400 mL浸泡液，待冷卻至室溫后進(jìn)行固相萃取。

1.4 固相萃取條件

依次使用5 mL甲醇、超純水活化固相萃取柱。活化后準(zhǔn)確量取400 mL浸泡液（將其pH調(diào)至相應(yīng)值）勻速（約1 mL/min）通過固相萃取柱。浸泡液經(jīng)萃取柱自然流出，加入2 mL超純水進(jìn)行清洗，抽干后再加入6 mL甲醇溶液進(jìn)行洗脫。萃取過程中流速約控制在1 mL/min，收集6 mL洗脫液，用氮吹儀吹至近干，定容至1 ml，過0.22 μm濾膜后置于樣品瓶中，待上機(jī)測(cè)定。

1.5 加壓毛細(xì)管電色譜條件

毛細(xì)管電色譜柱：EP-100-20/45-3-C18（內(nèi)徑100 μm，有效柱長(zhǎng)20 cm，填料粒徑3 μm ODS）。流動(dòng)相：甲醇和磷酸氫二鉀水溶液（20 mmol/L，用HCl調(diào)pH至8）。洗脫條件：0～6 min，甲醇由65%增加至70%，同時(shí)磷酸氫二鉀水溶液由35%逐漸降低至30%；6～30 min，甲醇由70%增加至90%，同時(shí)磷酸氫二鉀水溶液由30%逐漸降低至10%。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：常溫；流速：0.04 mL/min；外加電壓：+6 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件優(yōu)化

2.1.1 固相萃取小柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取Supelco EnviTM-Chrom P柱，DIKMA ProElut C18固相萃取柱，Waters OASIS HLB Cartridge柱，CHROMABOND XTR柱等四種固相萃取小柱，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)四種固相萃取小柱進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，對(duì)其吸附效率進(jìn)行比較。其中EnviTM-Chrom P柱采用苯乙烯二乙烯基苯作為填料，有最大數(shù)量的比表面積和最低的表面活性，能夠提供一個(gè)理想的液液分配的支撐表面，使得芳香胺類物質(zhì)有最大程度的回收率。通過毛細(xì)管電色譜進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）證明，利用Supelco EnviTM-Chrom P柱進(jìn)行萃取，能得到較好的回收效率，EnviTM-Chrom P柱對(duì)芳香胺的吸附效果最佳。所以本實(shí)驗(yàn)所以選取EnviTM-Chrom P小柱進(jìn)行固相萃取。

2.1.2 固相萃取洗脫溶劑以及洗脫體積的選擇

固相萃取洗脫溶劑的選擇關(guān)系到能否將吸附在固相萃取柱上的芳香胺完全洗脫下來，所以選擇合適的洗脫劑十分重要。由于芳香胺能溶于多數(shù)有機(jī)溶劑，本文選取了甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙醇等5種洗脫劑進(jìn)行優(yōu)化，從5種芳香胺的加標(biāo)回收率可以知道甲醇和乙腈能將5種芳香胺很好的洗脫下來，由于甲醇為pCEC的流動(dòng)相，所以選擇甲醇作為固相萃取的洗脫溶劑。

洗脫溶劑的體積也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。洗脫劑過多過少都不利于芳香胺的固相萃取。圖2為洗脫體積和目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率之間的關(guān)系。從圖中可以看出，6 mL和8 mL均能使五種芳香胺較好的洗脫下來，但是8 mL的洗脫液在接下來的氮吹過程中損失較多，所以選擇6 mL為最優(yōu)的洗脫體積。

2.1.3 樣品pH對(duì)吸附效率的影響

由于芳香胺帶有氨基，本實(shí)驗(yàn)研究了樣品pH在6、7、8、9和10時(shí)固相萃取柱對(duì)于芳香胺吸附效果的影響。將浸泡好的樣品400mL用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6、7、8、9和10后，在同樣的洗脫液、洗脫體積等萃取條件下進(jìn)行固相萃取，考察不同樣品pH對(duì)固相萃取吸附效率的影響。從表1可以看出，樣品pH越高，5種芳香胺的回收率越高，當(dāng)pH達(dá)到9時(shí)EnviTM-Chrom P固相萃取小柱對(duì)于目標(biāo)化合物的吸附作用最優(yōu)，而pH值調(diào)至10時(shí)，五種芳香胺的回收率呈下降趨勢(shì)。所以本實(shí)驗(yàn)將樣品pH調(diào)節(jié)到9后再進(jìn)行固相萃取。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 緩沖溶液濃度及其pH的影響

緩沖鹽對(duì)于毛細(xì)管電色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定以及目標(biāo)化合物的分離起著很重要的作用。在流動(dòng)相梯度保持相同、分離電壓設(shè)定為+6 kV、泵流速設(shè)定為0.04 mL/min的實(shí)驗(yàn)條件下，考察流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖液的濃度在5～50 mmol/L范圍內(nèi)（保持pH為8），分析物保留時(shí)間和分離效率的情況。結(jié)果顯示，隨著鹽溶液濃度越高，毛細(xì)管電色譜柱內(nèi)產(chǎn)生的焦耳熱越大，電色譜基線越不穩(wěn)定；同時(shí)，鹽濃度越小，離子濃度也越小，電滲流反而越大，使得芳香胺在反向色譜柱上的保留時(shí)間減小。但是考慮到鹽濃度的選擇應(yīng)該要不影響五種芳香胺的分離效率，所以本實(shí)驗(yàn)中緩沖鹽濃度選擇為20 mmol/L。

圖1 不同固相萃取小柱對(duì)五種芳香胺回收率的影響Fig.1 Effect of different SPE column on the recoveries of aromatic amines

圖2 不同固相萃取洗脫溶液體積對(duì)五種芳香胺回收率的影響Fig.2 Effect of elution volume on recoveries of the five aromatic amines

表1 樣品pH對(duì)固相萃取吸附效率的影響Tab.1 Effect of the sample pH on the solid phase extraction adsorption performance

因芳香胺為弱堿性物質(zhì)堿性，所以流動(dòng)相pH對(duì)其帶電情況和電滲流有很大影響。毛細(xì)管電色譜柱的pH允許范圍在2～9。本實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)流動(dòng)相pH在4～8之間變化時(shí)，芳香胺保留時(shí)間的改變情況(圖3)。

結(jié)果表明，芳香胺的保留時(shí)間隨pH增大而減小，同時(shí)分離度也有所提高。在pH為8的緩沖溶液中，本實(shí)驗(yàn)中五種芳香胺均能較好的分離。綜合考慮分析速度與色譜柱穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)采用pH為8的磷酸鹽緩沖液。

2.2.2 分離電壓的影響

因分離電壓產(chǎn)生的電滲流推動(dòng)力是pCEC分離的主要?jiǎng)恿χ?。不同電壓條件下芳香胺的保留時(shí)間不同。電壓太低，芳香胺的保留時(shí)間延長(zhǎng)；電壓過高又會(huì)使毛細(xì)管中形成氣泡，導(dǎo)致基線的噪音增大，所以選擇合適的電壓十分重要。在流動(dòng)相梯度、緩沖鹽濃度與pH值保持一致，泵流速設(shè)定為0.04 ml/min的實(shí)驗(yàn)條件下，考察分離電壓+2、+4、+6、+10 kV時(shí)，五種芳香胺的毛細(xì)管電色譜分離情況，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，分離電壓增大使得電滲流增大，分析物的保留時(shí)間減小，但分離電壓過大，五種化合物的分離與基線的穩(wěn)定情況明顯受到了影響，毛細(xì)管電色譜柱內(nèi)焦耳熱效應(yīng)增加，使分離效率降低。綜合考慮上述因素的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇+6kV的分離電壓。

在以上優(yōu)化的條件下，流動(dòng)相：甲醇和磷酸氫二鉀水溶液（20 mmol/L，用HCl調(diào)pH至8）進(jìn)行梯度洗脫，流速：0.04 mL/min，電壓+6 kV時(shí)，分離效果最好。

2.3 方法的精密度與準(zhǔn)確度

2.3.1 方法的線性范圍和檢出限

用上面的優(yōu)化方案對(duì)一系列濃度的3,3’-二甲基聯(lián)苯胺、鄰甲氧基苯胺、對(duì)氯苯胺、苯胺和2,6-二甲基苯胺等芳香胺溶液進(jìn)行檢測(cè)，其相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限見表2?？梢钥闯?，其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不低于0.99?；?倍信噪比的檢出限在1.0～4.0 mg/L之間。該方法分離效率良好，可以用于此五種芳香胺的檢測(cè)。

圖3 保留時(shí)間隨緩沖鹽pH變化的關(guān)系Fig.3 Effect of pH of buffer on the retention time

圖4 不同分離電壓對(duì)五種芳香胺分離效果的影響Fig.4 Effect of applied voltage on the separation of the five aromatic amines

表2 五種芳香胺的線性和檢出限Tab.2 Linear range,correlation coefficient and limit of detection（LOD）for the five kinds of aromatic amines

2.3.2 回收率和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法對(duì)添加樣品分別進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，以觀察方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。在空白樣品中添加三個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的操作方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，同時(shí)每個(gè)添加濃度平行重復(fù)3次，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見表3。

a標(biāo)準(zhǔn)偏差.

3 結(jié)論

毛細(xì)管電色譜具有高柱效和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，能使水產(chǎn)品中的芳香胺得到良好的分離與檢測(cè)，本文利用固相萃取-加壓毛細(xì)管電色譜法對(duì)水產(chǎn)品中五種芳香胺類物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，建立了一個(gè)同時(shí)測(cè)定五種芳香胺的加壓毛細(xì)管電色譜法。該方法利用EP-100-20/45-3-C18毛細(xì)管柱并在兩端施加+6 kV的電壓，在電滲流的推動(dòng)作用下對(duì)五種芳香胺進(jìn)行分離檢測(cè)。方法的線性關(guān)系良好，R2>0.99，五種芳香胺的檢出限在1.0～4.0 mg/L之間，方法的回收率>70.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<5.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，加壓毛細(xì)管電色譜法具有高效、快速、分離度好等優(yōu)點(diǎn)，能滿足水產(chǎn)品接觸材料中芳香胺的分析要求。

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