熊果酸對球囊損傷大鼠頸總動脈后內膜增生及PCNA、NF-kB表達的影響*

朱保成 夏 勇

(1.徐州醫(yī)學院心血管研究所，江蘇 徐州 221002；2.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科， 江蘇 徐州 221002)

隨著醫(yī)療科技的不斷發(fā)展，經皮冠狀動脈腔內血管成形術(PTCA)已經是治療冠心病的重要手段[1]。但其術后30%～50%的再狹窄率，嚴重限制了PTCA在臨床上的應用。藥物涂層支架的出現是冠心病介入治療的一個重大進展，可通過抑制血管的彈性回縮，預防晚期血管重塑，但經皮冠狀動脈介入治療的再狹窄率仍有5%～9%[2]。雷帕霉素及紫杉醇在體外實驗中可以顯著抑制血管平滑肌細胞的增殖[3]。熊果酸同樣為抗腫瘤藥物已經被證實具有抑制血管平滑肌細胞遷移增殖[4]，抗炎抗氧化[5]，抗動脈粥樣硬化等多重功效。因而，我們制作球囊損傷大鼠頸總動脈模型，研究熊果酸對血管平滑肌細胞遷移增殖的影響及可能機制，為預防PCI術后再狹窄及動脈粥樣硬化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠32只，體重300～350 g，購自徐州醫(yī)學院實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：按清潔級大鼠飼養(yǎng)，每籠放3～5只，實驗室光照，通風良好并按常規(guī)定期消毒。

1.1.2儀器及試劑 1.5 mm×15 mm球囊由美敦力公司提供，熊果酸購于上海晶純生化科技股份有限公司，NF-kB抗體購于北京中衫金橋生物技術有限公司。PCNA抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。SP試劑盒購于北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及給藥方法 將 32只大鼠隨機分為假損傷組(對照組)、頸總動脈球囊損傷組(模型組)、頸總動脈球囊損傷+ 熊果酸低劑量(低劑量組)、頸總動脈球囊損傷+ 熊果酸高劑量(高劑量組)，各組8只，每4只為一亞組，分別在術后7 d、21 d取頸總動脈。 對照組只進行手術操作但不插入球囊損傷，術后每天給予等量二甲基亞砜腹腔注射直至取標本；損傷組球囊損傷后給予等量二甲基亞砜腹腔注射直至取標本；熊果酸低劑量組，于造模前2天給予熊果酸每日劑量10 mg/kg 腹腔注射直至取出標本；熊果酸高劑量組，于造模前2天給予熊果酸每日劑量20 mg/kg 腹腔注射直至取出標本。

1.2.2頸總動脈球囊損傷模型的建立 苯巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠。麻醉后大腹面向上固定于手術操作臺上，備皮、常規(guī)消毒、鋪巾，頸部正中切口 ，鈍性分離皮下組織，暴露左側頸總動脈及左頸內、頸外動脈。永久結扎頸外動脈遠心段，并臨時結扎頸總動脈近心端和頸內動脈。 于頸外動脈剪一V形切口。將1.5 mm×15 mm球囊經頸外動脈切口插入頸總動脈，進至距頸內外動脈分叉處1～2 cm左右用壓力泵加壓并維持壓力2個大氣壓15秒，緩慢回拉導管至切口處將壓力泵回抽使壓力降為零。重復上述過程共3次，然后沿剪口近心端結扎頸外動脈，解除頸內、頸總動脈結扎線，逐層縫合皮下組織及皮膚。術后慶大霉素沖洗切口和腹腔注射肝素100 U/kg。

1.2.3標本收集 各組大鼠分別于術后7、21 d處死、取材。 用：苯巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠后，放血處死。取約1～2 cm長的左頸總動脈。PBS漂洗平均分為2段，浸入10%甲醛中于4冰箱固定。

1.2.4組織病理圖像分析 24h后將固定于10%甲醛溶液中的血管組織取出，脫水、透明、石蠟包埋。均勻切片(0.5 μm)，經HE染色后在光鏡下(×100)觀察組織形態(tài)學變化及內膜增生情況。采用光學顯微鏡和Image-pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對各組HE染色切片進行圖像分析，計算血管內膜面積(IA)和內膜與中膜面積比(IA/MA)。

1.2.5免疫組織化學檢測核因子(NF-kB)及增殖細胞核抗原(PCNA) 采用免疫組化SP法免疫組化染色，按試劑盒操作說明進行試驗。每段血管隨機選取3張切片，在高倍光學顯微鏡(×400)下觀測增殖情況，Image-pro Plus 6.0分析圖片，統(tǒng)計細胞陽性率。

1.3統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1熊果酸能減少頸動脈球囊損傷后內膜增厚程度，觀察術后7d、21d頸總動脈病理切片，見圖1。7d熊果酸高、低劑量組內膜面積(IA)和內膜與中膜面積比(IA/MA)較損傷組無明顯減少(P>0．05)。21d熊果酸高、低劑量組內膜面積(IA)和內膜與中膜面積比(IA/MA)較損傷組明顯減少(P<0．05)。21 d熊果酸高劑量組內膜面積(IA)和內膜與中膜面積比(IA/MA)較熊果酸低劑量組顯著減少(P<0．05)。(表1)。

2.27 d、21 d各組大鼠PCNA陽性細胞率

7d熊果酸高、低劑量組增生組織中可見PCNA表達的陽性率較損傷組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。21d熊果酸高、低劑量組增生組織中可見PCNA表達的陽性率較損傷組無明顯降低，差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。7d熊果酸高劑量組PCNA表達陽性率較熊果酸低劑量組減低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05),見圖2，表1。

2.37d、21 d各組大鼠NF-kB陽性細胞率

對照組兩時間點陽性細胞極少， 熊果酸高、低劑量組兩時間點增生組織中可見NF-kB表達的陽性率較損傷組均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。7d、21d熊果酸高劑量組NF-KB表達陽性率較低劑量組均減低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3，表1。

1.21天模型組；2.21天低劑量組；3.21天高劑量組；4.21天對照組

5.7天模型組；6.7天低劑量組；7.7天高劑量組；8.7天對照組

表1 7d、21d各組內膜面積(IA)和內膜與中膜面積比(IA/MA)及PCNA、NF-kB 免疫組化細胞陽性率情況

注：*P較21天模型組(<0.05)；#P較21天模型組(<0.05)；**P較7天模型組陽性率(<0.05)；##P較7天模型組(<0.05)；###P較21天模型組(<0.05)

圖1 7d、21d各組頸總動脈新生內膜增生情況(×100)

1.21天模型組；2.21天低劑量組；3.21天高劑量組；4.21天對照組;6.7天模型組；6.7天低劑量組；7.7天高劑量組；8.7天對照組

圖2 7d、21d各組PCNA表達的免疫組化情況(×400)

圖3 7d、21d各組NF-kB表達的免疫組化情況(×400)

3 討 論

PTCA術后再狹窄的形成與內膜增生、血管平滑肌細胞的遷移和增殖、血管彈性回縮以及炎癥有關已得到廣泛證實。其中血管平滑肌細胞(VSMC)的遷移和增殖與炎癥因子的作用是血管再狹窄的主要機制。本實驗主要研究熊果酸對球囊損傷大鼠頸總動脈內膜增生及核因子-kB的影響。

NF-kB是一類具有多向性轉錄調節(jié)作用的蛋白質家族。它在機體免疫、炎癥、細胞增殖、黏附等方面發(fā)揮重要的作用[6]。NF-kB是Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體的形式組成的一組轉錄因子。靜息狀態(tài)下，NF-kB蛋白二聚體與特異性抑制蛋白IKB形成三聚體，以非活化形式存在于細胞質中。當外界因素作用于細胞后，NF-kB得以激活，進入細胞核，繼而作用于靶基因，并迅速誘導基因表達，導致炎癥、增殖反應的發(fā)生。等實驗證明，NF-KB參與了AS中血管平滑肌細胞(vSMc)、血管內皮細胞(VEC)增殖和遷移的調節(jié)。熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、等多種生物學效應。Pozo[7]等率先報道了UA對大鼠頸動脈囊球導管血管損傷模型的影響。他們發(fā)現uA能抑制損傷血管內膜新生和中膜中血管平滑肌的遷移和增殖。本實驗中熊果酸減少了NF-kB的表達，使血管管腔較模型組增生減少。

PCNA是一種酸性核蛋白在DNA復制中起重要作用[8]，其含量在靜止期細胞極少。PCNA因此被認為是在正常和疾病狀態(tài)正在增殖的細胞的一個標志。為評估熊果酸在核水平調控血管平滑肌增殖的影響，我們檢測PCNA的表達。在本實驗中可觀測到增殖的血管平滑肌細胞中有大量PCNA的表達，而熊果酸可明顯抑制PCNA的表達。

經皮冠狀動脈介入治療(PCI)過程中，球囊損傷內皮及支架植入引起的炎癥反應引起血管平滑肌細胞(VSMCs)向內膜遷移增生，基質分泌導致的支架再狹窄又與動脈粥樣硬化的發(fā)生機制有相似之處。本實驗中熊果酸藥物組與損傷組比較，明顯減少內膜增生程度，其主要機制可能是NF-kB與MMPs、COX-2的表達有關[9]，待進一步證實。對于熊果酸與動脈粥樣硬化的關系尚有爭議[10]，需要更多論證。

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