單側(cè)耳蝸損毀后小鼠耳蝸核及下丘生長相關(guān)蛋白-43的表達(dá)

葉放蕾 李世超 陳蓓 王曉東

生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)又稱神經(jīng)調(diào)素、B-51、F1，是上世紀(jì)80年代初由Skene等[1，2]從兔再生的外周神經(jīng)中獲取的鈣調(diào)素連接蛋白，在脊椎動(dòng)物的非神經(jīng)組織中幾乎不表達(dá)，被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、損傷再生及突觸重建等事件中，?？梢詸z測(cè)到GAP-43 mRNA及蛋白質(zhì)水平顯著升高，被視為是神經(jīng)元發(fā)育與再生的一個(gè)內(nèi)在決定因子，被列為研究神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育及損傷后修復(fù)等神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的首選標(biāo)志物[3]。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立聽覺剝奪小鼠的動(dòng)物模型，觀察聽覺剝奪后小鼠耳蝸核及下丘生長相關(guān)蛋白-43表達(dá)的變化，以進(jìn)一步了解聽覺剝奪后小鼠聽覺腦干中樞的可塑性。

1 材料與方法

1.1聽覺剝奪動(dòng)物模型的制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年健康昆明小鼠30只，2～3月齡，體重25.00～35.00 g，平均29.50 g，雌雄不拘；無外耳道和中耳感染，耳廓反射靈敏，無噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。隨機(jī)分為單側(cè)耳蝸損毀術(shù)后3、7、15、30、60天組及對(duì)照組，每組5只。前5組小鼠用5%水合氯醛行腹腔注射麻醉(0.10 ml/10 g)，右側(cè)為術(shù)側(cè)，備皮，耳后切口，完全切除鼓室后壁，確定耳蝸位置，損毀耳蝸內(nèi)部結(jié)構(gòu)，注入無水酒精；用浸有適量氧氟沙星滴眼液和地塞米松混合液的明膠海綿填塞鼓室，縫合切口，行ABR檢測(cè)，120 dB SPL聲刺激未引出反應(yīng)波形則確認(rèn)造模成功。對(duì)照組僅行“假手術(shù)”，即：耳后切口，縫合，不損毀耳蝸。各組動(dòng)物保溫復(fù)蘇至蘇醒，置于正壓屏蔽環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2腦干標(biāo)本采集 對(duì)照組于術(shù)后當(dāng)天、耳蝸損毀后各組動(dòng)物于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出腦干制作組織切片。方法：4%多聚甲醛PBS溶液緩慢灌注至小鼠全身強(qiáng)直后, 斷頭，游離取出腦干組織，浸于4%多聚甲醛PBS溶液中固定。石蠟包埋，冠狀位連續(xù)切片，片厚度4 μm。隔5張取一張。

1.3免疫組化染色 二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原熱修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，封閉內(nèi)源性生物素等處理后，滴加一抗兔抗鼠GAP-43，放入4°C的冰箱過夜，37℃孵育40 min。滴加山羊抗兔二抗工作液約50μl覆蓋于組織上，37℃孵育40 min后封片觀察。免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒。

1.4計(jì)算機(jī)圖像分析 應(yīng)用Olympus BX51生物顯微鏡及鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院Biosens Digital Imaging System v1.6系統(tǒng)，對(duì)染色的全部切片行定量分析。于400倍鏡下隨機(jī)選取各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組耳蝸核及下丘無重疊的5個(gè)部位，檢測(cè)每張切片GAP-43陽性著色的平均光密度值(mean optical density，MOD)，MOD值越大GAP-43陽性表達(dá)越強(qiáng)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)各組間MOD值差異進(jìn)行分析，兩組間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)，多組間的兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1單側(cè)耳蝸損毀后小鼠耳蝸核GAP-43的表達(dá) 單側(cè)耳蝸損毀后3、7、15天組，術(shù)耳同側(cè)耳蝸核GAP-43含量水平呈上升趨勢(shì)，較對(duì)照組及術(shù)耳對(duì)側(cè)表達(dá)升高；術(shù)后30天，術(shù)耳同側(cè)耳蝸核GAP-43表達(dá)水平開始下降，但仍高于對(duì)照組和對(duì)側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后60天，GAP-43表達(dá)水平與對(duì)照組及對(duì)側(cè)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)耳對(duì)側(cè)各時(shí)間點(diǎn)耳蝸核GAP-43含量水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1、圖1)。

表1 對(duì)照組及單側(cè)耳蝸損毀后各組兩側(cè)耳蝸核及下丘GAP-43平均光密度

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；△與對(duì)側(cè)同時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05

圖1 對(duì)照組及單側(cè)耳蝸損毀后不同時(shí)間組兩側(cè)耳蝸核及下丘GAP-43平均光密度趨勢(shì)圖

光鏡下可見對(duì)照組耳蝸核中GAP-43陽性染色很弱，陽性表達(dá)水平低或?yàn)殛幮裕植加诙伾窠?jīng)元細(xì)胞膜周圍。耳蝸損毀術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠耳蝸核中GAP-43陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的分布和對(duì)照組大致相同，但陽性染色顯著加深，陽性顆粒明顯增多(圖2)。

2.2單側(cè)耳蝸損毀后小鼠下丘GAP-43的表達(dá) 光鏡下見對(duì)照組下丘中GAP-43陽性染色較弱，陽性表達(dá)水平低，彌散在神經(jīng)元細(xì)胞胞漿內(nèi)，分布較均勻。單側(cè)耳蝸損毀后各組下丘中GAP-43陽性產(chǎn)物的分布部位與對(duì)照組大致相同，但陽性染色顯著加深，陽性顆粒顯著增多，陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目有不同程度的增加(圖3)。

圖2 各組動(dòng)物耳蝸核GAP-43表達(dá)(免疫組化染色×400) a、b、c、d、e、f分別為對(duì)照組和術(shù)后3、7、15、30、60天組

小鼠單側(cè)耳蝸損毀后3、7、15天，術(shù)耳同側(cè)和對(duì)側(cè)下丘GAP-43表達(dá)水平較正常對(duì)照組逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且術(shù)耳同側(cè)的表達(dá)水平低于對(duì)側(cè)(P<0.05)；術(shù)后30天術(shù)耳同側(cè)和對(duì)側(cè)表達(dá)水平逐漸下降，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，且術(shù)側(cè)表達(dá)低于對(duì)側(cè)(P<0.05)(表1、圖1)；術(shù)后60天，其表達(dá)繼續(xù)下降，術(shù)耳同側(cè)及對(duì)側(cè)與對(duì)照組、術(shù)耳同側(cè)與對(duì)側(cè)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

3 討論

GAP-43作為一種突觸前蛋白，主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，非神經(jīng)組織中很少表達(dá)，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、軸突的再生和可塑性等緊密聯(lián)系。在個(gè)體發(fā)育期間，GAP-43在聽覺腦干核特征性表達(dá)，成熟后在這些核團(tuán)中表達(dá)消失[4]。它通過引導(dǎo)軸突生長和調(diào)節(jié)新連接形成而影響軸突生長能力,即使在缺乏其它營養(yǎng)因子時(shí)也能使神經(jīng)元發(fā)出新的終末[5]。

Michler等[6]發(fā)現(xiàn)強(qiáng)純音損傷后，術(shù)后3天大鼠外側(cè)橄欖核GAP-43微量表達(dá), 術(shù)后9天表達(dá)增強(qiáng),第3周達(dá)到高峰,表達(dá)持續(xù)約1.5 年；耳蝸切除后3～16天，對(duì)側(cè)外側(cè)橄欖核GAP-43陽性表達(dá)持續(xù)升高,可維持1年，說明耳蝸損毀后橄欖核表現(xiàn)出了中樞重塑。楚銅等[7]發(fā)現(xiàn)大鼠單側(cè)耳蝸損毀后耳蝸核內(nèi)GluR2/3受體表達(dá)亦呈現(xiàn)出一過性先升高后降低的過程，進(jìn)而引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)功能改變，聽覺中樞重塑。耳蝸核作為哺乳動(dòng)物聽覺中樞系統(tǒng)的第1級(jí)聽覺中樞,位于延腦的上方,同側(cè)聽神經(jīng)入腦后，終止于耳蝸核團(tuán)中的前腹側(cè)核、后腹側(cè)核及背核，接受同側(cè)耳蝸信息的傳入, 并與上級(jí)中樞及其它聽覺中樞核團(tuán)密切聯(lián)系，對(duì)接受的聲信號(hào)進(jìn)行初步加工整合；研究[8]表明，聲信號(hào)傳入受阻后，耳蝸核首先發(fā)生重組。從本研究結(jié)果看，在單側(cè)耳蝸損毀后，小鼠同側(cè)耳蝸核內(nèi)GAP-43的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低的過程，可能與聽覺中樞去外周神經(jīng)后，啟動(dòng)了耳蝸核內(nèi)潛伏狀態(tài)的神經(jīng)元，GAP-43mRNA轉(zhuǎn)錄增加，使GAP-43表達(dá)增加；而術(shù)耳對(duì)側(cè)耳蝸核GAP-43表達(dá)無明顯變化，可能是由于耳蝸核主要接受同側(cè)蝸神經(jīng)刺激的緣故。具體GAP-43mRNA轉(zhuǎn)錄增加的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

下丘是腦干聽覺中樞對(duì)聲信號(hào)刺激進(jìn)行加工處理和傳遞的主要中繼核團(tuán)，下丘神經(jīng)元對(duì)聲刺激的反應(yīng)復(fù)雜,全部聽覺上行和下行通路都在下丘形成一一映射的突觸聯(lián)系，正是這種聯(lián)系使下丘具備了興奮和抑制雙重效應(yīng)[9]。下丘中央核團(tuán)最少接受4個(gè)低位不同聽覺核團(tuán)同側(cè)及對(duì)側(cè)的纖維傳入，調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜；郜元坤等[10]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)耳蝸損毀后，大鼠雙側(cè)下丘內(nèi)GAP-43表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后下降的過程；本研究結(jié)果顯示單側(cè)耳蝸損毀后，小鼠雙側(cè)下丘內(nèi)GAP-43表達(dá)均呈先升高后下調(diào)的過程，可能正常情況下蝸神經(jīng)產(chǎn)生抑制性信號(hào)，抑制下丘內(nèi)神經(jīng)元表達(dá)GAP-43，當(dāng)去除外周神經(jīng)后，下丘神經(jīng)GAP-43的表達(dá)增加。李孟等[11]指出雙側(cè)耳蝸損毀后聽覺皮層突觸素亦一過性升高，表明在耳蝸損毀后聽覺皮層亦出現(xiàn)重塑現(xiàn)象；Meidinger等[12研究亦發(fā)現(xiàn)大鼠單側(cè)耳蝸損毀后，在聽覺皮層內(nèi)GAP-43的表達(dá)亦有相似的變化；此過程可能與大腦皮層神經(jīng)元軸突再生或突觸的重新形成有關(guān)，但其具體機(jī)制仍在研究中。

關(guān)于聽覺中樞重塑性的研究日益增多，GAP-43作為調(diào)節(jié)軸突出芽生長和軸突導(dǎo)向的重要蛋白，已成為研究神經(jīng)再生和軸突可塑性機(jī)制的關(guān)鍵蛋白。軸突的再生及突觸的重新建立需要一系列信號(hào)分子的協(xié)同作用，此過程尚需進(jìn)一步研究。

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