耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的耐藥機制及同源性研究

韋柳華

[摘要] 目的 分析柳州市4所醫(yī)院耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的耐藥機制及同源性，為指導(dǎo)臨床合理用藥、控制感染提供依據(jù)。 方法 69株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌分離自柳州市工人醫(yī)院（甲醫(yī)院），中醫(yī)院（乙醫(yī)院）、婦幼保健院（丙醫(yī)院）和柳鐵中心醫(yī)院（丁醫(yī)院）。采用紙片擴散法及微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗，采用脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析菌株同源性，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測β-內(nèi)酰胺酶基因和OprD2基因，使用氰氯苯腙（CCCP）進行主動外排泵篩選試驗。 結(jié)果 69株銅綠假單胞菌對多黏菌素B和氨基糖苷類的耐藥率較低，對頭孢他定、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為40.6%、40.6%、44.9%，其他抗菌藥物的耐藥率均>50%；β-內(nèi)酰胺酶基因IMP陽性率為4.3%，OprD2基因陽性率為63.8%，VIM、KPC、GIM、OXA和SPM基因均未檢出；主動外排表型陽性率為82.6%。PFGE分型分為A～J共10個基因型，其中A型為主要基因型，占44.1%；4所醫(yī)院均存在克隆傳播，甲、乙、丙、丁醫(yī)院分別以A型、H型、D型、C型克隆株傳播為主，甲、乙醫(yī)院有共同的B型克隆株存在，甲、丁醫(yī)院有共同的A型克隆株存在。 結(jié)論 克隆株在醫(yī)院內(nèi)、醫(yī)院間播散已成為柳州市耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌分離率不斷上升、菌株不斷增加的主要原因，主動外排泵高表達、OprD2蛋白表達缺失和產(chǎn)IMP型金屬酶是該菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制。

[關(guān)鍵詞] 銅綠假單胞菌；耐藥機制；同源性

[中圖分類號] R378.99+1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）04（b）-0004-04

[Abstract] Objective To analyze drug resistance and homology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa of four hospitals in Liuzhou city for providing the basis of the clinical rational use of drugs and controling infection. Methods 69 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa were isolated from Worker′s Hospital （A Hospital），Hospital of Traditional Chinese Medicine （B Hospital）， Maternal and Child Health Hospital （C Hospital） and Liu Railway Central Hospital （D Hospital）.Drug sensitive test was conducted by by disk diffusion and broth micro dilution，the homology of bacterial strain was analyzed by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE），gene of β-lactamase and OprD2 was detected by PCR，active efflux pump screening test was conducted by CCCP. Results In 69 strains of Pseudomonas aeruginosa，drug resistance rate of polymyxin B and aminoglycoside was lower，ceftazidime，cefoperazone / shubatan and piperacillin/tazobactam was 40.6%，40.6%，44.9% respectively，other antibiotic′s resistance rate was >50%；the positive rate of β-lactamase gene IMP was 4.3% and the positive rate of OprD2 was 63.8%，strains positive for gene VIM，KPC，GIM，OXA and SPM were not detected；the positive rate of active efflux phenotype was 82.6%.There were 10 genotype by PFGE named A-J，the major A type was 44.1%；four hospitals（ A，B，C and D Hospital） all contained clone transmission and clone strain transmission of A，B，C and D Hospital was mainly type A，type H，type D，type C respectively，both A and B Hospital exsited type B clone strain，both A and D Hospital existed type A clone strain. Conclusion Clone strain spread in the hospital and among hospitals has become the main reason of the isolated rate of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa rising，and strain increasing in Liuzhou city，the main mechanism of drug resistance of Pseudomonas aeruginosa to carbapenem drugs was high expression of active efflux pump，OprD2 protein expression loss and production IMP type metal enzyme.

[Key words] Pseudomonas aeruginosa；Drug resistance mechanism；Homology

近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，在藥物的選擇壓力下，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的分離率也在不斷增高[1-4]，給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)。本研究對柳州市4所醫(yī)院臨床分離的69株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌進行耐藥性、同源性及碳青霉烯類抗生素相關(guān)耐藥基因和主動外排泵機制分析，以初步闡明引起醫(yī)院內(nèi)感染菌株的耐藥機制和同源性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 69株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌均為2010年1月～2012年3月柳州市4所三級甲等醫(yī)院住院患者送檢標(biāo)本中分離所得，同一患者多次分離到的菌株不重復(fù)計入，其中工人醫(yī)院（甲醫(yī)院）50株，中醫(yī)院（乙醫(yī)院）7株、婦幼保健院（丙醫(yī)院）8株、柳鐵中心醫(yī)院（丁醫(yī)院）4株。細菌鑒定和藥敏試驗的質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸埃希菌ATCC 25922，脈沖場電泳Marker所用菌株為Braenderup血清型的沙門菌H9812。

1.1.2 主要儀器 CHEF Mapper 脈沖場凝膠電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）、Microscan Autoscan-4微生物分析儀（西門子公司，德國）、Vitek2 Compact全自動微生物分析儀（生物梅里埃公司，法國）、ABI 7300 PCR儀（ABI，美國）。

1.1.3 主要試劑 NC31 型檢測板（西門子公司，德國），GN卡和E-test試條（生物梅里埃公司，法國），限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、XbaⅠ（Promega ，美國），SeaKem Gold 脈沖場凝膠電泳瓊脂糖（CAMBREX，美國），蛋白酶K（MERCK，德國），十二烷基肌氨酸鈉、Tris緩沖液、EDTA、硼酸等（Sigma，美國），氰氯苯腙 CCCP（Sigma，美國），抗菌藥物紙片（OXOID，英國），PCR試劑（上海英濰貿(mào)易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定和藥敏試驗 采用Microscan Autoscan-4和Vitek2 Compact微生物分析儀進行細菌鑒定。采用紙片擴散法（K-B法）及微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗，按CLSI 2012年標(biāo)準(zhǔn)[5]判斷結(jié)果。

1.2.2 β-內(nèi)酰胺酶基因與OprD2基因檢測 采用PCR檢測VIM基因、IMP基因、KPC基因、GIM基因、OXA基因、SPM基因和OprD2基因。DNA模板制備、引物序列、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件詳見參考文獻[6]。擴增產(chǎn)物送上海英濰貿(mào)易有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank上經(jīng)BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）比對分析，確定基因型。

1.2.3 主動外排泵篩選試驗 配制水解酪蛋白（M-H）瓊脂和含CCCP（終濃度70 mg/L，該濃度對外排泵有較好的抑制作用，而對細菌生長無影響）的M-H 瓊脂平皿，挑取2～3個過夜培養(yǎng)的菌落，用生理鹽水調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，按照K-B法操作涂布菌懸液和粘貼亞胺培南E-test試條，放35℃培養(yǎng)24 h，觀察CCCP對亞胺培南的MIC的逆轉(zhuǎn)作用。當(dāng)存在CCCP時亞胺培南的MIC比缺乏時相應(yīng)的MIC下降至原值的1/4或更低，則判斷為外排泵陽性株，提示主動外排機制存在。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳 從69株銅綠假單胞菌中篩選出34株細菌進行脈沖場凝膠電泳（PFGE）。具體操作：銅綠假單胞菌經(jīng)細胞裂解液和蛋白酶裂解后，用內(nèi)切酶SpeⅠ過夜消化凝膠栓中的基因組DNA，然后凝膠栓嵌入1%瓊脂糖凝膠，將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中電泳。電泳參數(shù)：脈沖時間6.75～35.38 s，電泳時間20 h，溫度14℃，電場夾角120°，電場強度6 V/cm。沙門菌 H9812作為電泳分子量標(biāo)記 Marker。然后在EB溶液中染色30 min，純水脫色1 h，在凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。所獲得的圖像用BioNumerics 6.6軟件導(dǎo)入指紋圖譜庫，運用該軟件的clustering 功能，根據(jù)條帶的差異，用UPGMA法進行聚類分析。PFGE的判讀按美國疾病控制和預(yù)防中心Tenover等[7]的肉眼判定標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合BioNumerics軟件分析的UPGMA法[8]。①無法區(qū)分：肉眼0條帶不同，UPGMA法為100%相似；②緊密相關(guān)型：肉眼2～3條帶不同，UPGMA法相似度為80%以上；③有可能有關(guān)：肉眼4～6條帶不同，UPGMA法相似度為80%以上；④不同：肉眼≥7條帶不同，UPGMA法相似度為80%以下。①、②和③被判斷為有克隆相關(guān)性，可歸為同一克隆，如A克隆，其中①為A1亞型，②和③分別命名為A2亞型，A3亞型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用WHONET 5.6軟件對藥敏結(jié)果進行分析，使用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗

多黏菌素B、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素對該菌保持較強的抗菌活性，耐藥率分別為0、11.6%、20.3%、21.7%，其次為頭孢他定、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦，耐藥率分別為40.6%、40.6%、44.9%（表1）。

2.2 耐藥基因檢測

69株銅綠假單胞菌中，僅3株檢測出IMP 基因，陽性率為4.3%，測序為IMP-1型金屬酶基因（GenBank登錄號：AB472901.2），OprD2基因缺失44株，陽性率為63.8%，其余耐藥基因（VIM、KPC、GIM、OXA和SPM）均未檢出。

2.3 主動外排泵篩選試驗

在CCCP作用下，69株銅綠假單胞菌中有57株細菌對亞胺培南的MIC下降至原值的1/4或更低，主動外排表型陽性率為82.6%。