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    連續(xù)中壓PVPP柱層析純化茶多酚及EGCG的研究

    2014-06-09 05:16:38高彥華
    化工科技 2014年3期
    關(guān)鍵詞:層析柱柱層析咖啡因

    高彥華,陳 穎

    (東北石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 石油與天然氣化工省重點實驗室,黑龍江 大慶 163318)

    茶多酚是從茶葉中提取的多酚類活性物質(zhì),具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、降血脂、防輻射等多種重要的生物活性,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域。其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚中的主要生物活性成分,是目前科研和產(chǎn)品開發(fā)的熱點[1-5]。因此,茶多酚的提取及EGCG的純化研究已受到廣泛關(guān)注。

    作者前期研究[6]表明,采用硅膠進(jìn)行柱層析可以對茶多酚及EGCG的分離取得較理想的效果,柱層析系統(tǒng)中,柱塞泵的驅(qū)動力可大大縮減分離周期,提高分離效率。但是,對環(huán)境造成污染,同時也給混合溶劑的回收帶來困難,操作也比較繁瑣。交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是一種不溶于水、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及一般有機(jī)溶劑的交聯(lián)聚合物。作為一種重要的高分子精細(xì)化工產(chǎn)品,PVPP是一種無毒、無刺激性、安全穩(wěn)定的聚合物,具有很強(qiáng)的選擇吸附能力,能夠通過羰基與多酚類物質(zhì)形成氫鍵絡(luò)合物[7-8]。因此,作者在前期工作的基礎(chǔ)上,以PVPP為填料,以丙酮為洗脫劑,研究了連續(xù)中壓柱層析對茶多酚及EGCG的分離和純化,取得了令人滿意的效果,縮短了生產(chǎn)周期,克服了敞口常壓柱層析生產(chǎn)周期長,分離效果差,且易逸出有機(jī)溶劑蒸氣污染環(huán)境等不足,減少了對環(huán)境造成的污染,大大降低了生產(chǎn)成本。

    1 實驗部分

    1.1 試劑與儀器

    PVPP:分析純,北京中生瑞泰科技有限公司;EGCG等標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于98%,美國Sigma公司;色譜檢測試劑乙腈、乙酸乙酯、硫酸:色譜純,美國DimaTechnology Inc公司;TLC色譜板:硅膠HF254,上海源葉科技有限公司。

    連續(xù)不銹鋼中壓層析系統(tǒng):玻璃層析柱根據(jù)文獻(xiàn)[6]自制,柱長1 500 mm,內(nèi)徑200 mm,耐壓20 MPa;2J-X16/15柱塞式計量溶劑泵:杭州之江科學(xué)儀器廠;層析儀:自制;SHB-IIIG循環(huán)水式多用真空泵:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;R201D旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器:上海申勝公司;D99型臺式高速微型離心機(jī):寧波新芝科器研究所;LC-1500高效液相色譜儀:1580泵,UV- 1575紫外檢測器,日本Jasco公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 提取液的制備

    茶多酚提取液根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]從新鮮老齡綠茶葉中提取,并經(jīng)過膜分離處理得反滲透膜濃縮的茶多酚提取液。其中w(茶多酚)=41.05%,w(EGCG)=17.16%。

    1.2.2 靜態(tài)吸附解吸過程

    稱取一定量的PVPP加入適量去離子水充分溶脹后去水[w(水)=12%,下同],加入茶多酚提取液,常溫下于搖床中充分吸附,加入除雜劑除雜質(zhì)后,加入洗脫劑洗脫,濃縮得濃縮液。取樣,離心分離,檢測w(EGCG)。

    1.2.3 動態(tài)吸附解吸過程

    1.2.3.1 層析柱裝填

    稱取一定量溶脹后PVPP(以絕干質(zhì)量計,下同)于層析柱內(nèi),使PVPP均勻填滿整個柱體不留死體積,用砂芯板和法蘭封口,將層析柱安裝至層析儀上,氮氣加壓,用柱塞泵泵入洗脫液以一定流速淋洗直至柱平衡。

    1.2.3.2 動態(tài)吸附解吸條件的確定

    室溫下泵入茶多酚提取液,以一定流速通過層析柱,進(jìn)行動態(tài)吸附實驗,測定流出液中w(EGCG),繪制出PVPP的動態(tài)吸附曲線。同時,考察洗脫流速對PVPP解吸性能的影響,確定最佳的解吸條件。

    1.2.3.3 柱層析純化過程

    稱取一定量的茶多酚提取液,用柱塞式溶劑泵進(jìn)液,除雜劑除雜質(zhì)后,洗脫液洗脫,洗脫液分段收集,TLC及HPLC檢測,合并,減壓濃縮回收洗脫液。低純度組分收集后作為層析原料再次純化。有效成分經(jīng)檢測全部流出后,層析柱經(jīng)再生處理后可再次上樣,反復(fù)使用。

    1.2.4 w(茶多酚)、w(EGCG)及w(咖啡因)的分析方法

    w(茶多酚)測定采用GB8313—87分析檢測;w(EGCG)采用文獻(xiàn)[7]提供的高效液相色譜法(HPLC)分析;w(咖啡因)采用GB8312—87分析檢測。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 靜態(tài)吸附結(jié)果

    2.1.1 m(PVPP)對吸附效果的影響

    稱取1~8 g PVPP,分別加入150 mL茶多酚提取液[ρ(EGCG)=10.01 mg/mL,下同],于搖床中充分吸附,考察m(PVPP)對吸附效果的影響,結(jié)果見圖1。

    由圖1可知,m(PVPP)越大,EGCG吸附率越大。但當(dāng)m(PVPP)>6 g時,EGCG吸附率增大不明顯,考慮到經(jīng)濟(jì)因素以及方便后處理,確定PVPP最佳用量為6 g,即每克PVPP吸附EGCG0.25 g。

    m(PVPP)/g圖1 m(PVPP)對吸附效果的影響

    2.1.2 PVPP靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

    稱取6 g PVPP加入150 mL茶多酚提取液,于搖床中進(jìn)行吸附60 min。每10 min取樣檢測,PVPP對EGCG的吸附動力學(xué)曲線見圖2。

    t/min圖2 PVPP的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

    由圖2可知,隨吸附時間的增加,EGCG吸附率逐漸增加,但當(dāng)吸附時間超過30 min后,其EGCG吸附率增加不明顯,因此,確定最佳的吸附時間為30 min。實踐證明,較短的平衡時間為PVPP的工業(yè)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。其吸附前后萃取液HPLC譜圖對比見圖3和圖4。

    t/min圖3 吸附前溶液高效液相色譜圖

    t/min圖4 吸附后溶液高效液相色譜圖

    由圖3、圖4對比分析可知,EGCG能夠有效地被吸附,咖啡因吸附少量,大部分殘留在吸附后的溶液中而被除去。因此,選用PVPP吸附,效果較理想。

    2.1.3 EGCG的吸附等溫線的測定

    稱取6 g PVPP 5份,分別加入150 mL茶多酚提取液于搖床中吸附30 min,考察不同溫度的吸附效果,結(jié)果見圖5。

    t/℃ 圖5 EGCG的吸附等溫線

    由圖5可知,PVPP對EGCG的吸附效果隨溫度的升高雖表現(xiàn)為先增大后減少的趨勢,但相對較緩慢。分析其原因為當(dāng)溫度升高,一方面分子熱運(yùn)動加快,增加了PVPP與EGCG分子間的碰撞幾率,有利于吸附反應(yīng)的進(jìn)行。同時高溫有利于解吸反應(yīng),不利于吸附反應(yīng),因此也使EGCG吸附率下降。2種因素的結(jié)合效果說明,當(dāng)溫度在25~45 ℃,吸附速率的增大速度比解吸速率的增大速度快,EGCG的吸附率增大。當(dāng)溫度高于45 ℃時,解吸速率增大速度比吸附速率的增大速度快,EGCG的吸附率下降。從圖5顯示的結(jié)果也可以看出,當(dāng)溫度25~45 ℃時,吸附率增加不明顯,考慮到節(jié)省能耗因素,采用常溫條件作為PVPP與EGCG吸附的溫度。

    2.1.4 除雜劑的篩選

    考慮到待分離的提取液中含有較多的色素、咖啡因、糖類、蛋白以及其它極性大的雜質(zhì),首先選擇了常用的經(jīng)濟(jì)適用且綠色無污染的去離子水。另外考慮了極性較大的不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇及丙酮,通過HPLC跟蹤檢測發(fā)現(xiàn),低體積分?jǐn)?shù)的上述3種溶劑雖可不同程度除去雜質(zhì),但在后續(xù)的EGCG洗脫過程中即使選用高濃度甲醇和乙醇這2種溶劑,EGCG洗脫率均較低,而考慮到后續(xù)過程不宜再增加新溶劑,盡量選擇同一類除雜劑及洗脫劑,選擇了低體積分?jǐn)?shù)丙酮進(jìn)一步除雜。

    取6 g按上述最佳吸附條件吸附后的PVPP,加入120 mL去水離子水水洗,水洗液HPLC譜圖見圖6,加入φ(丙酮)=10%丙酮溶液250 mL洗脫,洗脫液HPLC譜圖見圖7。

    t/min圖6 水洗液高效液相色譜圖

    t/min圖7 φ(丙酮)=10%洗脫液高效液相色譜圖

    由圖6可知,水洗能夠?qū)⑽皆赑VPP上的色素、咖啡因、糖類以及蛋白等雜質(zhì)部分除去,同時還將溶于水的極性較大的雜質(zhì)部分除去。由圖7可知,φ(丙酮)=10%的丙酮溶液不僅能夠?qū)⑺次赐耆サ目Х纫虺?,而且能夠?qū)⒁徊糠謽O性較大的雜質(zhì)、色素部分除去,達(dá)到進(jìn)一步純化的目的。

    2.1.5 洗脫液體積分?jǐn)?shù)的確定

    稱取32 g PVPP分成4等份,按上述方法吸附以及除雜后,向每份內(nèi)分別加入不同丙酮溶液各600 mL進(jìn)行洗脫,洗脫液離心,減壓濃縮,浸膏干燥至質(zhì)量恒定,HPLC檢測,計算EGCG回收率及質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見圖8。

    φ(丙酮)/%圖8 不同φ(丙酮)洗脫效果對比

    由圖8可知,不同φ(丙酮)對EGCG的洗脫率是不同的,其中φ(丙酮)=90%時丙酮洗脫回收率最高為86.21%。從質(zhì)量分?jǐn)?shù)來看,4種體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑洗脫產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)相仿,均約為53%,因此,在保證w(EGCG)相差不多的情況下,盡量選擇洗脫EGCG總量多的φ(丙酮),因此確定最佳洗脫劑為φ(丙酮)=90%。

    2.2 動態(tài)吸附解吸附條件的確定

    將提取液分別控制不同流速進(jìn)行動態(tài)吸附,確定最佳上樣流速;再用水、φ(丙酮)=10%丙酮溶液以及φ(丙酮)=90%丙酮溶液分別采用不同流速連續(xù)通過層析柱洗脫,計算出回收率,然后以流速為橫坐標(biāo)、吸附率和回收率為縱坐標(biāo)作圖,結(jié)果見圖9。

    流速/(mL·min-1)圖9 不同流速對EGCG的吸附率及回收率的影響

    由圖9可以看出,隨著流速的增加,PVPP對EGCG的吸附率及回收率均有所降低,流速越低吸附率和回收率越高,但流速過低將導(dǎo)致吸附解吸過程周期過長,因此建議以30 mL/min流速為好。

    2.3 柱層析純化結(jié)果

    按照靜態(tài)吸附所確定的最佳吸附及解吸條件進(jìn)行放大實驗,按要求分別調(diào)配好φ(丙酮)=10%丙酮除雜液以及φ(丙酮)=90%洗脫液于溶劑瓶中,w(NaOH)=4%的PVPP再生液裝于再生液溶劑瓶中。稱取60 g PVPP于中壓柱內(nèi),用柱塞式溶劑泵泵入φ(丙酮)=90%平衡層析柱,泵入1 500 mL茶多酚提取液后,經(jīng)1 200 mL去水離子水水洗,2 500 mLφ(丙酮)=10%溶液除雜,再泵入5 000 mLφ(丙酮)=90%洗脫液洗脫,洗脫液分段收集,每份100 mL,用薄層層析及HPLC跟蹤分析檢測,合并,減壓濃縮回收洗脫液。濃縮液再經(jīng)乙酸乙酯萃取后,真空干燥得產(chǎn)品。低純度組分收集后作為層析原料再次純化。

    經(jīng)上述柱層析純化后,可制備w(茶多酚)>98%,w(咖啡因)<1%,w(EGCG)=60.12%的產(chǎn)品,EGCG回收率為85.25%。

    2.4 PVPP的再生

    由于PVPP是一種價格昂貴的高分子精細(xì)化學(xué)品,而良好的重復(fù)使用性能則將會大大降低生產(chǎn)成本。為此通過對吸附-解吸后的PVPP再生處理,研究其再生性能。再生方法為將使用過的PVPP用去離子水沖洗后,用w(NaOH)=4%的溶液浸泡24 h,過濾后再用去離子水沖洗干凈即可。實驗表明,再生PVPP的收率達(dá)到95%以上,再生PVPP對EGCG的吸附性能在重復(fù)使用5次以上,PVPP的吸附性能無明顯降低,結(jié)果見表1。由表1可見,PVPP具有較好的重復(fù)使用性能。

    表1 PVPP再生性實驗結(jié)果1)

    1) 再生PVPP處理量為6 g。

    3 結(jié) 論

    以PVPP為填料,丙酮為洗脫劑,研究了連續(xù)中壓柱層析對茶多酚及EGCG的分離和純化,實驗得到的主要結(jié)論如下。

    (1) PVPP靜態(tài)吸附研究表明,PVPP最佳用量為每克PVPP吸附EGCG0.25 g,常溫吸附,吸附時間30 min;除雜劑為去離子水以及φ(丙酮)=10%丙酮溶液,最佳洗脫劑為φ(丙酮)=90%丙酮溶液。

    (2) 連續(xù)中壓柱層析分離最佳工藝條件為1 500 mm ×200 mm的自制不銹鋼中壓層析柱,流速為30 mL/min,經(jīng)PVPP充分吸附后,去離子水和φ(丙酮)=10%丙酮除雜后,用φ(丙酮)=90%丙酮洗脫,洗脫液回收溶劑后,經(jīng)乙酸乙酯萃取,萃取液經(jīng)濃縮、真空干燥后可將w(EGCG)提高至60.12%,回收率為85.25%。w(茶多酚)>98%,w(咖啡因)<1%。

    (3) 采用丙酮進(jìn)行除雜及洗脫,使溶劑的回收更加方便快捷,避免了環(huán)境污染。

    (4) PVPP具有較好的再生重復(fù)使用性,大大降低了生產(chǎn)成本。

    [ 參 考 文 獻(xiàn) ]

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