豆渣固體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲粉條件優(yōu)化及三萜化合物含量的測(cè)定

王世強(qiáng)，李雨桐，唐巧巧

（黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041）

靈芝俗稱芝草、仙草、瑞草。在分類學(xué)上屬于真菌擔(dān)子菌門、層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬[1，2]。靈芝富含多糖、蛋白質(zhì)、多肽類、三萜類化合物（靈芝酸）、有機(jī)鍺、甾體皂甙及多種微量元素，是著名的藥用菌。靈芝多糖、三萜類化合物是靈芝的主要活性物質(zhì)[3，4]，是靈芝發(fā)揮扶正固本、提高自身免疫能力，促使機(jī)體器官機(jī)能正?；πУ奈镔|(zhì)基礎(chǔ)。據(jù)研究，靈芝菌絲體中的粗多糖含量明顯高于靈芝子實(shí)體及孢子粉中多糖的含量，其菌絲體中粗多糖含量是老化期子實(shí)體中粗多糖含量的6倍，是靈芝孢子粉中粗多糖含量的2.8倍[5]。

一般非谷物性培養(yǎng)料固體法培養(yǎng)靈芝菌絲，不具有可食性；采用谷物性培養(yǎng)料固體法培養(yǎng)靈芝菌絲，由于多糖測(cè)定方法相同，培養(yǎng)料淀粉多糖與菌絲多糖難以分離測(cè)定，效果難以確定；人們一直以來(lái)采用液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)獲得靈芝純菌絲體，但液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體設(shè)備昂貴、生產(chǎn)技術(shù)要求高，菌絲產(chǎn)量低。本研究旨在通過(guò)靈芝菌絲所含特征化合物—三萜化合物測(cè)定，以解決培養(yǎng)物中靈芝菌絲含量的測(cè)定方法，探討豆渣代料固體法生產(chǎn)可食性、靈芝菌絲粉的可能性，為富含靈芝多糖、三萜類化合物靈芝菌絲粉大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 ．材料與方法

1.1 材料與儀器

豆渣葡萄糖培養(yǎng)基：豆渣為黃山市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買；

韓芝（休寧食用菌研究所）；

齊墩果酸（上海金穗生物科技有限公司）。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液：精確稱取105℃干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品0.0046g于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容；

香草醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），香草醛溶液：5g香草醛用100ml冰醋酸進(jìn)行溶解；硫酸溶液(V/V)：取水 28ml，加硫酸至 100ml。

MJ－160B－Ⅱ型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；

YX280A型高壓蒸汽滅菌器 （上海三申醫(yī)療器械有限公司）；

FA2104-B型電子天平 （上海越平科學(xué)儀器有限公司）；

pH-300型酸度計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）；

SW-CJ-IC型超凈工作臺(tái) （蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；

721分光光度計(jì)（上海天普分析儀器有限公司）；

DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；

THZ-82B型氣浴恒溫振動(dòng)器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；

HH-S4數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（金壇岸頭儀都儀器廠）；

冰箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝菌絲粉生產(chǎn)工藝流程

固體發(fā)酵法：斜面菌種→原種→接種→培養(yǎng)→靈芝菌絲培養(yǎng)物→60℃烘干→粉碎→過(guò)篩→樣品靈芝菌絲粉；液體發(fā)酵法：斜面菌種→接種入100ml馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基→26℃,140-150rpm搖瓶培養(yǎng)14d→過(guò)濾取菌絲→60℃烘干→研磨→純靈芝菌絲粉[6，7]。

1.2.2 顯色方法[8]

實(shí)驗(yàn)采用的顯色方案為5%香草醛-冰醋酸0.5ml，72%硫酸 5ml，65℃恒溫水浴加熱 20min，冰水中靜置5min后測(cè)定。

1.2.3 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]

分別精密量取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0ml(空白)、0.1ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置于 10ml具塞容量瓶中，即配成的溶液濃度為0.0000mg/ml、0.0046mg/ml、0.0184mg/ml、0.0368mg/ml、0.0552mg/ml、0.0736mg/ml，用乙酸乙酯定容至10ml，按1.2.2顯色方法顯色，以空白為參比，于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=2.1344x-0.0023；R2=0.9963。

1.2.4 樣品的測(cè)定

樣品中三萜化合物測(cè)定通常采用齊墩果酸作為對(duì)照品。分別精密稱取試驗(yàn)樣品及純靈芝菌絲粉0.2g置于100ml燒瓶中，加氯仿約90ml，置水浴中加熱，回流1h后，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移入100ml容量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，再濾液備用。

精密吸取三萜類化合物提取液1.0ml于10ml比色管中，按1.2.2項(xiàng)“加熱揮去溶劑后”進(jìn)行操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

1.2.5 靈芝培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

豆渣含有豐富的蛋白質(zhì)，碳水化合物，參考一般天然成分固體培養(yǎng)基添加糖為1%左右，靈芝菌絲生長(zhǎng)溫度為6-35℃，菌絲發(fā)滿容器后5-10d 即可現(xiàn)菇蕾（菌絲老化）的固體法靈芝菌絲體的營(yíng)養(yǎng)發(fā)育條件[10，11]，選用料糖比、培養(yǎng)溫度、菌絲滿瓶后再培養(yǎng)時(shí)間作為豆渣固體法靈芝菌絲體培養(yǎng)的考察因素，取其各自不同的水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以單位重量菌絲粉三萜化合物含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 靈芝培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理豆渣培養(yǎng)基上靈芝菌絲生長(zhǎng)勢(shì)狀況

樣品中靈芝菌絲三萜化合物含量與靈芝菌絲生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)，在菌絲培養(yǎng)的中期通過(guò)放大鏡觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，通過(guò)瓶壁菌絲10d菌絲蔓延伸長(zhǎng)值的測(cè)定，除以10換算菌絲培養(yǎng)中期日伸長(zhǎng)值；每瓶裝干豆渣80g，使其含水量達(dá)65%左右，通過(guò)培養(yǎng)料在瓶中相同的重量及松緊度，菌絲日伸長(zhǎng)值，菌絲發(fā)滿時(shí)間考察菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)；菌絲培養(yǎng)物60℃烘干后粉碎，稱重。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同處理豆渣培養(yǎng)基上靈芝菌絲生長(zhǎng)勢(shì)

由表2可知,菌絲生長(zhǎng)勢(shì)與菌絲培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)料/糖比密切相關(guān)。在同一料/糖比條件下，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)受溫度影響，2、5、8號(hào)實(shí)驗(yàn)組，其菌絲日伸長(zhǎng)最高，可見(jiàn)靈芝菌絲最適宜的生長(zhǎng)溫度為28℃，其他實(shí)驗(yàn)組在24℃或32℃培養(yǎng)，可能由于酶的活性降低，生長(zhǎng)勢(shì)減弱；菌絲日伸長(zhǎng)與菌絲發(fā)滿瓶正相關(guān)而成反比，日伸長(zhǎng)值越高，發(fā)滿菌瓶時(shí)間越短。在同一溫度條件下，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)受料/糖比影響，4、5、6 號(hào)實(shí)驗(yàn)組料/糖比為2%，菌絲平均日伸長(zhǎng)最高，為0.561mm。

2.2 靈芝菌絲體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

依據(jù)表1的工藝參數(shù)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

從表3中的數(shù)據(jù)分析可知，根據(jù)極差的大小，影響靈芝菌絲中三萜化合物含量的影響因素的順序是：A〉B〉C，即料/糖比，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)靈芝菌絲中三萜化合物含量的影響依次減小，通過(guò)直觀性分析可知：利用豆渣培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝菌絲體的最佳條件為 A2B1C3，即料/糖比為 100：2；培養(yǎng)溫度為24℃；培養(yǎng)時(shí)間為長(zhǎng)滿瓶后12d，有利于菌絲三萜化合物的積累。結(jié)合表2分析可知，高濃度的糖組菌絲粉得率高，但菌絲粉三萜化合物含量低，顯示高濃度糖對(duì)原料的利用、菌絲生長(zhǎng)及三萜化合物的積累有抑制作用。

2.3 液體發(fā)酵與固體發(fā)酵靈芝菌絲體結(jié)果比較

以固體發(fā)酵培養(yǎng)靈芝菌絲體影響因子最大，最佳料/糖比為100：2的菌絲粉得率平均值與液體發(fā)酵培養(yǎng)靈芝菌絲體得率結(jié)果比較見(jiàn)表4。

表4 液體發(fā)酵與固體發(fā)酵靈芝菌絲體結(jié)果比較

從表4可看出,其固體發(fā)酵每g菌絲粉中三萜化合物的量較低，為純菌絲粉中三萜化合物50.1%，是由于固體發(fā)酵菌絲粉其中含有部分培養(yǎng)料，菌絲粉不純的原因。但固體發(fā)酵法菌絲粉得率高，三萜化合物總量高。

3 結(jié) 論

1.利用豆渣培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝菌絲體，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)與菌絲培養(yǎng)溫度、料/糖比密切相關(guān)。培養(yǎng)溫度在28℃，料/糖比為 100：2，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，菌絲滿瓶時(shí)間最短。

2.以單位重量菌絲粉含三萜化合物量為目標(biāo)函數(shù)，利用豆渣培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝菌絲體的最佳條件則為料/糖比為100：2；培養(yǎng)溫度為24℃；培養(yǎng)時(shí)間為菌絲長(zhǎng)滿瓶后12d。盡管固體發(fā)酵法菌絲粉三萜化合物含量低，但固體發(fā)酵法菌絲粉得率高，三萜化合物總量高，80g固體發(fā)酵物三萜化合物總量是100mL液體發(fā)酵純菌絲三萜化合物總量的16.3倍。

4 討 論

1.豆渣是豆制品的下腳料，豆渣中含脂肪6-19%，粗蛋白13-16%，粗纖維和碳水化合物60-70%，可溶性膳食纖維5-8%[12]。本實(shí)驗(yàn)證明豆渣是靈芝菌絲培養(yǎng)的良好基料，即變廢為寶減少污染，又增加效益。

2.液體深層發(fā)酵法能獲得純菌絲粉，但設(shè)備昂貴、通氣、攪拌耗電，易被污染，技術(shù)難度大，菌絲體得率低。固體發(fā)酵法雖然菌絲粉純度只有純菌絲的40-50%，但培養(yǎng)基原料易得、廉價(jià)，省去通氣攪拌電耗，不易污染，技術(shù)難度低，菌絲體得率高，可大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。

3.近年來(lái)，以谷物作為基料進(jìn)行靈芝固體發(fā)酵的研究較少，高文庚等采用玉米、小麥、大豆作為發(fā)酵基質(zhì)，對(duì)最終產(chǎn)品——靈芝發(fā)酵粉中靈芝粗多糖、還原糖、蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定分析[13]，但樣品中淀粉對(duì)靈芝粗多糖含量測(cè)定結(jié)果影響難以避免?；诰z細(xì)胞生長(zhǎng)——細(xì)胞各成分有規(guī)律按比例增加原理。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)樣品及純菌絲特有三萜化合物的測(cè)定，可間接了解樣品中菌絲體的含量和靈芝菌絲多糖的含量，該菌絲粉可食性也為靈芝功能性食品及保健品的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟了廣闊的前景。

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