臨滄市2012年高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗的AIDS患者耐藥基因變異分析

楊翕然，楊翠先，楊紹敏，邊中啟

臨滄市2012年高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗的AIDS患者耐藥基因變異分析

楊翕然，楊翠先，楊紹敏，邊中啟

目的了解臨滄市2012年經(jīng)高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy,HAART）失敗的AIDS患者耐藥基因的變異情況。方法調(diào)查HAART失敗AIDS患者的流行病學(xué)特征，檢測CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)和病毒載量，對HIVRNA＞1×103copies/m l的患者行HIV-1耐藥基因檢測。結(jié)果66例中有53例檢出基因耐藥突變。最常見的核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變位點為M184V、D67N和K70R，非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變位點為K103N、G190A和V179D。僅發(fā)現(xiàn)3個蛋白酶抑制劑突變位點，分別為D33F、M46I和L76V。結(jié)論臨滄市AIDS患者出現(xiàn)較多反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑突變位點是一線抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗的主要原因。在選擇二線治療方案時，增加蛋白酶抑制劑可避免多重耐藥導(dǎo)致的治療失敗。

獲得性免疫缺陷綜合征；抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，高效；抗藥性

高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy,HAART）能有效降低HIV感染者的發(fā)病率和病死率，使已被破壞的免疫功能得到重建，大大降低母嬰傳播的幾率。但隨著HAART的廣泛開展，在藥物選擇壓力下出現(xiàn)了交叉耐藥和多重耐藥[1-2]。為了解云南省臨滄市一線抗病毒治療失敗AIDS患者的耐藥情況，我們對2012年臨床治療失敗的AIDS患者進(jìn)行耐藥基因檢測，以期為二線治療方案的選擇提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象66例為2012年臨滄市一線抗病毒治療失敗的AIDS患者，于當(dāng)?shù)貦z測HIV RNA載量和CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)后，將血漿樣本送至我院行HIV-1耐藥基因檢測，并收集其臨床及流行病學(xué)資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：抗病毒治療＞6個月，HIV RNA＞1× 103copies/ml和（或）CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)低于治療前基線水平。

1.2 方法根據(jù)《國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊》[3]，治療方案為2種核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NRTIs）聯(lián)合1種非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs）或蛋白酶類抑制劑（protease inhibitors,PIs）。采集治療失敗患者的臨床資料和隨訪信息，用美國BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)，西門子Versant Molecular 440檢測病毒載量。對HIV RNA＞1×103copies/ml者用美國Abbottm2000sp進(jìn)行核酸提取，采用反轉(zhuǎn)錄套式聚合酶鏈反應(yīng)擴增HIV pol區(qū)DNA，擴增產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心測序。得到長度約1300 bp，包括HIV-1 pol區(qū)基因序列的蛋白酶基因全長1～99氨基酸和反轉(zhuǎn)錄酶基因至少前1～254個氨基酸。用ContigExpres軟件進(jìn)行序列的整理和拼接，將結(jié)果上傳至美國斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行耐藥基因型分析，并對樣本的藥物敏感性進(jìn)行分析，分為敏感、潛在耐藥、低度耐藥、中度耐藥和高度耐藥，敏感和潛在耐藥歸為敏感，低度及以上耐藥記為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 一般情況66例中男38例，女28例；年齡18～76歲，平均36歲。異性性傳播46例（69.7%），通過靜脈吸毒傳播15例（22.7%），母嬰垂直傳播1例（1.5%），感染途徑不詳4例（6.1%）。其中49例（74.2%）正在服用復(fù)方磺胺甲噁唑。開始抗病毒治療時間為10～72個月，平均29個月。HAART方案組合為齊多夫定（AZT）+拉米夫定（LAM）+奈韋拉平（NVP）（48.5%，32/66）、AZT+LAM+依非韋倫（EFV）（28.8%，19/66）、司他夫定（d4T）+LAM+ NVP（15.2%，10/66）、d4T+LAM+EFV（6.1%，4/66）、LAM+洛匹那韋/利托那韋（1.5%，1/66）。66例的CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)和HIV RNA載量見表1。53例樣本擴增成功，其中單藥耐藥22例（41.5%），2種及以上多重耐藥31例（58.5%）。

表1 66例患者CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)和HIV RNA載量Table 1 CD4+T lymphocyte count and HIV RNA load of 66 patients

2.2 NRTIs耐藥情況53例中對NRTIs耐藥者33例（62.3%），與NRTIs相關(guān)的主要耐藥突變位點有11個，最常見的為M184V（31例）、D67N（5例）、K70R（4例）、M41L（3例）和T215F（3例），突變率分別為58.5%、9.4%、7.5%、5.7%和5.7%。

2.3 NNRTIs耐藥情況53例中對NNRTIs耐藥者49例（92.5%），主要的相關(guān)耐藥突變位點有18個，最常見的為K103N（29例）、G190A（9例）、V179D（9例）、Y181C（7例）和P225H（7例），突變率分別為54.7%、17.0%、17.0%、13.2%和13.2%。

2.4 PIs耐藥情況53例中僅1例對PIs耐藥。與PIs相關(guān)的耐藥突變位點是D33F、M46I和L76V，突變率為1.9%。

3 討論

HIV耐藥的產(chǎn)生主要是由于病毒反轉(zhuǎn)錄酶與蛋白酶的基因突變，從而導(dǎo)致對藥物的敏感性降低[4]。本研究中突變率最高的為M184V（58.5%），31例M184V突變者均對LAM顯示高度耐藥。然而LAM的耐藥變異可反轉(zhuǎn)AZT的耐藥株，使其恢復(fù)對AZT的敏感性，并延緩AZT耐藥株的出現(xiàn)，因此LAM耐藥株的出現(xiàn)對LAM+AZT的聯(lián)合應(yīng)用影響不大[5]。M184V還可阻礙或延遲腺苷類耐藥突變的發(fā)生[6]。有文獻(xiàn)報道M41L和T215F突變可能導(dǎo)致對AZT和d4T耐藥[7]。本研究中3例T215F突變者均對AZT和d4T高度耐藥；3例M41L突變者中有2例對AZT和d4T高度耐藥，1例為潛在耐藥。目前尚未發(fā)現(xiàn)D67N和K70R與哪些耐藥相關(guān)，待進(jìn)一步研究。

有文獻(xiàn)報道，5%～15%的HIV新近感染者至少存在1個對某種抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物耐藥的變異，NNRTIs的初始耐藥率最高，在美國為6.9%；NRTIs和PIs的初始耐藥率分別為3.6%和2.4%[8]。本研究中NNRTIs突變率最高的為K103N（54.7%），被認(rèn)為與EFV和NVP耐藥相關(guān)，29例K103N突變者均顯示對EFV和NVP高度耐藥；G190A與EFV和NVP耐藥高度相關(guān)，9例G190A突變者均對EFV和NVP中度以上耐藥，這與之前云南省的報道一致[9]。V179D曾被認(rèn)為與NNRTIs的低度耐藥相關(guān)，但對包含NNRTIs方案的有效性并無意義，當(dāng)V106I與V179D聯(lián)合突變時，已被證明可導(dǎo)致EFV耐藥[10]。本研究未發(fā)現(xiàn)V106I突變。Y181C與NVP和地拉夫定耐藥高度相關(guān)[11]，本組有7例Y181C位點突變。53例樣本中，僅發(fā)現(xiàn)1例對PIs耐藥，該患者M(jìn)46L和L76V位點發(fā)生突變，提示其對除阿扎那韋、沙奎那韋及替拉那韋外的PIs均耐藥；另1例L33F發(fā)生突變，但未顯示耐藥。蛋白酶基因表達(dá)的主要區(qū)域為D30N和M46I，若發(fā)生突變將對PIs耐藥產(chǎn)生重要作用，M46I突變會對除沙奎那韋以外茚地那韋、利托那韋、安普那韋和奈非那韋多種PIs產(chǎn)生耐藥[12]。

本組53例耐藥者中，多重耐藥率達(dá)58.5%，主要為NRTIs和NNRTIs耐藥，這與我國的一線治療方案為2種NRTIs+1種NNRTIs有關(guān)。而作為二線治療方案中的PIs由于應(yīng)用較少，耐藥率較低。當(dāng)發(fā)生NNRTIs耐藥時通常選用的方案為2種敏感的NRTIs+PIs；當(dāng)對某一種PIs耐藥時，可考慮使用其他更強效的PIs[13]。當(dāng)出現(xiàn)多位點突變時，突變位點之間的相互作用反而會降低病毒對某種藥物的耐受，部分耐藥位點會改變病毒的關(guān)鍵蛋白，使病毒復(fù)制力下降，當(dāng)中斷抗病毒治療后，耐藥株會快速被野生型毒株所替代[14]。服藥依從性也是HAART成功與否的關(guān)鍵，由于藥物的不良反應(yīng)以及須長時間、多次服藥，容易導(dǎo)致服藥依從性不良，最終產(chǎn)生耐藥。在治療開始前，充分評估藥物敏感性，選擇恰當(dāng)?shù)姆桨?，避免交叉耐藥，加強AIDS患者的依從性教育，可有效減少耐藥發(fā)生。

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（2013-09-12收稿 2013-12-18修回）

（責(zé)任編委 張玲霞 本文編輯 陳玉琪）

Drug resistancemutations in AIDS patients failing highly active antiretroviral therapy in Lincang,Yunnan province,in 2012

YANG Xi-ran,YANG Cui-xian,YANG Shao-min*,BIAN Zhong-qi
AIDSCare Center Laboratory,Yunnan Provincial Hospital of Infectious Diseases,Kunming,Yunnan 650301,China
*Corresponding author,E-mail:smy57@sina.com

Objective To investigate HIV drug resistance mutations in AIDS patients failing highly active antiretroviral therapy(HAART)in Lincang,Yunnan province,in 2012.M ethods Epidemiological characteristics of AIDS patients failing in HAARTwere investigated.CD4+T lymphocyte count and viral load were detected,and HIV-1 resistance testing was conducted on those patients with viral load more than 1000 copies/m l.Results Among 66 patients failing in HAART,drug resistance mutations were found in 53 patients.Themost common nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistancemutations were M184V,D67N and K70R,and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance mutations were K103N,G190A and V179D.Only 3 protease inhibitor(PI)resistancemutations were found,and they were D33F,M46I and L76V,respectively.Conclusions The emergence of reverse transcriptase resistancemutations is themain reason for the failure of first-line antiretroviral therapy(ART)in AIDS patients in Lincang,Yunnan province.Therefore,when switching to second-line ART,the increased use of PI can avoid ART failure due to multidrug resistance.

acquired immunodeficiency syndrome;antiretroviral therapy,highly active;drug resistance

R512.91；R915

A

1007-8134(2014)03-0164-03

國家“十一五”科技重大專項（2012ZX10001-002）

650301昆明，云南省傳染病?？漆t(yī)院艾滋病關(guān)愛中心檢驗科[楊翕然（現(xiàn)在昆明醫(yī)科大學(xué)研究生部）、楊翠先、楊紹敏]；650032，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院感染科（邊中啟）

楊紹敏，E-mail:smy57@sina.com