既往有償獻(xiàn)血HIV-1感染者中合并感染的HCV對(duì)telaprevir和boceprevir天然耐藥分析

鮑毅，田地，鄭穎穎，席宏麗，劉丹，于敏，徐小元

既往有償獻(xiàn)血HIV-1感染者中合并感染的HCV對(duì)telaprevir和boceprevir天然耐藥分析

鮑毅，田地，鄭穎穎，席宏麗，劉丹，于敏，徐小元

目的分析既往有償獻(xiàn)血人群HIV-1感染者中合并感染的HCV對(duì)telaprevir和boceprevir的天然耐藥，為HCV的耐藥監(jiān)測(cè)及臨床抗病毒治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法收集既往有償獻(xiàn)血人群HIV陽(yáng)性患者的血漿樣本，檢測(cè)其HCV抗體，應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增HCV NS3/4A區(qū)，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行耐藥分析，計(jì)算耐藥率，評(píng)價(jià)耐藥毒株的流行趨勢(shì)。結(jié)果從150份符合要求的樣本里共獲得70份（46.67%）HCV NS3/4A基因序列。檢測(cè)出耐藥相關(guān)突變4例（5.71%），其中對(duì)boceprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點(diǎn)為R117H和A156V；對(duì)telaprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點(diǎn)為R117H和A156V；對(duì)telaprevir可能耐藥2例（2.86%），耐藥位點(diǎn)為T54S。尚未發(fā)現(xiàn)V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已報(bào)道的耐藥位點(diǎn)。其他突變中，氨基酸替換率超過(guò)90%的變異位點(diǎn)有I35V、A40T、R62K、I64L、V71I、S66G、S91A和T42S；在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，耐藥序列呈點(diǎn)狀散在分布，未發(fā)現(xiàn)聚集性。結(jié)論既往有償獻(xiàn)血HIV-1感染者中合并感染的HCV對(duì)telaprevir和boceprevir存在天然耐藥，耐藥相關(guān)突變率分別為5.71%和2.86%。其他氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)突變率較高，但是未發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)。各耐藥菌株之間未發(fā)現(xiàn)傳播關(guān)聯(lián)性。

丙型肝炎病毒；HIV；蛋白酶抑制藥；藥物耐受性；供血者

HIV和HCV有著共同的傳播途徑：血液傳播、性傳播和垂直傳播，因此HIV-1和HCV常發(fā)生合并感染[1-2]。在我國(guó)，以靜脈注射毒品和輸血為傳播途徑的HIV-1感染者中，合并HCV感染率達(dá)85%～97%[3-4]。一般情況下，70%以上的HCV感染可能發(fā)展為慢性，其中有10%～20%在感染20年后可發(fā)展至肝硬化，1%～5%在感染30年后可發(fā)展為肝癌[5]。當(dāng)合并HIV-1感染時(shí)，HIV-1通過(guò)對(duì)免疫抑制或免疫紊亂的影響引起HCV感染后復(fù)制水平升高，肝硬化發(fā)病率更高，疾病進(jìn)展更快[6-7]?？梢?jiàn)對(duì)合并HCV/ HIV感染者進(jìn)行有效的抗HCV治療是有必要的。

近年來(lái)，HCV的直接抗病毒治療藥物研究進(jìn)展迅速，針對(duì)NS3/4A的蛋白酶抑制劑（boceprevir和telaprevir）已在美國(guó)上市，其中美國(guó)Vertex公司研制的telaprevir聯(lián)合聚乙二醇干擾素（pegylated interferon,Peg-IFN）和利巴韋林治療HCV基因1型感染的病毒學(xué)應(yīng)答率達(dá)80%以上，優(yōu)于Peg-IFN聯(lián)合利巴韋林的抗HCV治療[8-9]，其應(yīng)用前景已寫入2011年最新的歐洲肝臟病學(xué)會(huì)HCV感染管理指南[10-12]。但HCVNS3區(qū)的V36M/A、T54A、R155K/T和A156V/ T變異可引起病毒耐藥[13]，有研究發(fā)現(xiàn)在未接受治療的患者中可檢出耐藥位點(diǎn)，而引起天然耐藥[14-15]。目前我國(guó)既往有償獻(xiàn)血人群中HIV-1/HCV合并感染者對(duì)蛋白酶抑制劑的耐藥情況尚不清楚。

本研究對(duì)我國(guó)中部地區(qū)20世紀(jì)90年代中期因有償獻(xiàn)血感染HIV-1者的血液標(biāo)本中合并感染的HCV進(jìn)行耐藥檢測(cè)，了解其對(duì)telaprevir和boceprevir的天然耐藥特征。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象150份由北京佑安醫(yī)院艾滋病中心2005—2007年收集的河南省有償獻(xiàn)血者血漿，均經(jīng)當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心采用Western blot法確證為HIV感染。HCV IgG抗體檢測(cè)采用意大利DiaSorin公司生產(chǎn)的HCV抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。采集血液之前，患者未使用任何抗病毒藥物、干擾素和蛋白酶抑制劑，血樣經(jīng)乙二胺四乙酸（EDTA）-2k抗凝，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 HCVRNA的提取從每份樣本中取200μl血漿，按照MiniBESTViralRNA/DNAExtraction KitVer. 4.0試劑盒（TaKaRa公司，大連）說(shuō)明提取HCVRNA。

1.3 巢式PCR基因片段的擴(kuò)增參照HCV標(biāo)準(zhǔn)株（H77，基因庫(kù)編號(hào)AF009606）的序列，按巢式PCR法設(shè)計(jì)合成2對(duì)PCR引物，使用PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2擴(kuò)增HCV NS3/4A區(qū)。反應(yīng)條件如下：第1輪，以HCV NS3F1/HCV NS3R1為外側(cè)引物，取2×1 Step Buffer 12.5μl，PrimeScript One Step Enzyme1 1μl，引物各2μl，7.5μlRNA為反應(yīng)模板，配成25μl的反應(yīng)體系，進(jìn)行第1次PCR反應(yīng)，50℃30min，94℃2min，1個(gè)循環(huán)；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。第2輪，以HCV NS3F2/HCV NS3R2為內(nèi)側(cè)引物，10×Ex緩沖液5μl，10mmol/L 4dNTPmix（final2.5mmol/L）4μl，Ex Taq（5 U/μl）0.3μl，引物各4μl，去離子水27.7μl，取第1輪PCR產(chǎn)物5μl做模板，配成50μl的反應(yīng)體系，94℃5min，1個(gè)循環(huán)；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。具體引物序列見(jiàn)表1。每次實(shí)驗(yàn)前后嚴(yán)格清理超凈工作臺(tái)、移液器和試驗(yàn)臺(tái)，并用紫外線消毒，嚴(yán)格做陰性對(duì)照。

1.4 電泳和測(cè)序取5μl第2輪PCR產(chǎn)物，用2.0%瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳30min。電泳結(jié)果與100 bp的Marker比對(duì)，鑒定無(wú)誤后，PCR產(chǎn)物送到北京諾賽公司測(cè)序，引物為HCV NS3seq：5'-CCTATCACGGCACTCCCAACA-3'。

1.5 耐藥性分析擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序獲得基因序列，在HCV數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hcv.lanl.gov/content/sequence/ HCV/ToolsOutline.htm l）網(wǎng)站下載HCV參考株序列，用MEGA 4.02軟件Align by clustalW比對(duì)基因序列，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。提交HCV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hcv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php）［Geno2Pheno（hcv）V1.0 table，Max-Planck-Institute Informatik, Saarbrucken,Germany］進(jìn)行分析，尋找boceprevir/ telaprevir耐藥相關(guān)突變。病例樣本檢測(cè)結(jié)果按抗病毒藥物敏感、潛在耐藥和耐藥進(jìn)行評(píng)估判斷。

表1 HCV NS3/4A區(qū)擴(kuò)增的巢式PCR引物的名稱、序列、位置和長(zhǎng)度Table 1 Name,sequence,position and length of HCV NS3/4A area augmentation of nested PCR primers

2 結(jié)果

2.1 一般情況150例年齡29～60歲，平均44.7歲；其中男86例，女64例；HCV抗體陽(yáng)性106例。共成功測(cè)序獲得70份（46.67%）HCV NS3/4A基因序列，序列長(zhǎng)度約790 bp，提交到HCV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因1b型68例（97.14%），基因2a型2例（2.86%）。

2.2 耐藥位點(diǎn)提交所有序列到HCV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)T54S、A156V、R117H這3個(gè)耐藥位點(diǎn)。耐藥樣本4例，具體耐藥位點(diǎn)分別是HNDB2：T54S，HNDB22：A156V，HNDB31：R117H，HNDB34：T54S（圖1）。

2.3 耐藥率分析許多體內(nèi)和體外研究已發(fā)現(xiàn)HCV NS3/4A區(qū)的氨基酸替換可導(dǎo)致對(duì)蛋白酶抑制劑耐藥，本研究檢測(cè)到的耐藥位點(diǎn)有T54S、R117H和A156V，分別占2.86%、1.43%和1.43%。耐藥樣本共4例（5.71%），其中對(duì)boceprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點(diǎn)為R117H（1.43%）和A156V（1.43%）；對(duì)telaprevir耐藥2例（2.86%），耐藥位點(diǎn)為R117H（1.43%）和A156V（1.43%），對(duì)其可能耐藥2例（2.86%），耐藥位點(diǎn)為T54S。未檢測(cè)到V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已報(bào)道的耐藥位點(diǎn)[13，16-17]（表2）。

圖1 既往有償獻(xiàn)血感染HIV-1人群中HCV NS3/4A區(qū)對(duì)boceprevir/telaprevir的耐藥位點(diǎn)Figure 1 HCV NS3/4A resistance loci of boceprevir/tela-previr in previous paid blood donorsw ith HIV-1 infection

表2 HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑耐藥突變的分布Table 2 Distribution of HCV NS3/4A protease inhibitor resistancemutations

2.4 其他突變位點(diǎn)除了以上發(fā)生耐藥突變的氨基酸位點(diǎn)外，HCV NS3/4A還發(fā)生其他的堿基變異導(dǎo)致氨基酸替換。根據(jù)H77參考株，本組中替換率最高的為I35V和A40T（均高達(dá)100%），其次是R62K、I64L、V71I等，高達(dá)97.1%；S66G、S91A和T42S替換率分別是95.7%、92.9%和91.4%。

2.5 HCV NS3/4A序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析70份基因序列經(jīng)過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，HNDB19和HNDB24聚集在參考株2a-JFH-1-AB047639，屬于2a型；其他序列都聚集在參考株1b-AH1-AB429050，屬于1b型，標(biāo)記的耐藥序列呈點(diǎn)狀散在分布，未發(fā)現(xiàn)聚集性。

3 討論

HCV是丙型肝炎的病原體，為黃病毒科，球形顆粒，直徑約50 nm，有包膜。其基因組為單股正鏈的RNA病毒，全長(zhǎng)約9.6 kb，含1個(gè)開(kāi)放閱讀框，HCV基因組翻譯成1個(gè)聚蛋白前體，可經(jīng)蛋白酶水解為10個(gè)具有多種生物活性的病毒蛋白：Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，這些病毒蛋白在HCV的生活史中發(fā)揮著重要的作用[18]。病毒復(fù)制時(shí)的高自然錯(cuò)配率（大約每個(gè)基因每次復(fù)制周期可發(fā)生1個(gè)核苷酸錯(cuò)配）及RNA聚合酶的低保真性導(dǎo)致HCV基因極易突變，產(chǎn)生耐藥，成為直接抗病毒治療藥物臨床研究中的主要挑戰(zhàn)[19]。

目前對(duì)慢性HCV感染以干擾素加利巴韋林為主要治療手段[20]，但價(jià)格昂貴，不良反應(yīng)較多，因此急需新型抗HCV藥物的出現(xiàn)[8-9]。多種針對(duì)HCV的新型藥物如蛋白酶抑制劑和RNA聚合酶抑制劑等已被證明可強(qiáng)效抑制HCV復(fù)制，迅速降低血清HCVRNA水平，并縮短療程。Telaprevir和boceprevir現(xiàn)已在美國(guó)上市[10-12]。

然而，由于基因變異的影響，在同一患者體內(nèi)存在一系列HCV的準(zhǔn)種群，當(dāng)進(jìn)行抗病毒治療時(shí)，藥物的選擇壓力可導(dǎo)致耐藥菌株成為優(yōu)勢(shì)株，從而引起繼發(fā)耐藥[21]。但如果用藥前耐藥變異株在病毒準(zhǔn)種池中已成為相對(duì)優(yōu)勢(shì)株，在用藥后能迅速成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)株而引起原發(fā)耐藥[15，22]，這種情況已在未經(jīng)治療的慢性丙型肝炎中得到發(fā)現(xiàn)。Franco等[14]采用Allelespecific PCR檢測(cè)45例未治療的HCV基因1b型感染者的天然耐藥，檢測(cè)到A156T 23例（51%），A156V 13例（29%），A156S1例（2%）和V36A 12例（27%）等耐藥突變。Bartels等[17]研究發(fā)現(xiàn)570例未治療的HCV感染者體內(nèi)的HCV存在耐藥變異，產(chǎn)生耐藥位點(diǎn)分別是V36M（0.9%）、R155K（0.7%）、V170A（0.2%）和R109K（0.2%）。Vicenti等[15]對(duì)67例基因1a亞型和42例基因1b亞型未接受蛋白酶抑制劑治療的意大利HCV感染者測(cè)序發(fā)現(xiàn)，至少有1個(gè)突變位點(diǎn)的有21例（19.3%），10例檢測(cè)到與boceprevir和telaprevir耐藥相關(guān)突變（9.2%），耐藥位點(diǎn)是V36L、T54S和V55A，其中1例同時(shí)檢測(cè)到V36L和T54S突變。

本研究檢測(cè)到T54S（2.86%）、A156V（1.43%）和R117H（1.43%）3個(gè)耐藥位點(diǎn)，耐藥樣本4例（5.71%）。R117H/A156V單獨(dú)突變都能引起telaprevir和boceprevir耐藥，T54S單獨(dú)突變只能引起telaprevir的可能耐藥，不能引起boceprevir耐藥。尚未發(fā)現(xiàn)V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/ E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已報(bào)道的耐藥位點(diǎn)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率較低，可能的原因是標(biāo)本存放較久。所有樣本雖然未使用蛋白酶抑制劑，但仍然檢測(cè)到了部分國(guó)外已經(jīng)報(bào)道的耐藥位點(diǎn)，提示我國(guó)HCV感染者天然存在對(duì)telaprevir和boceprevir耐藥。根據(jù)H77參考株，檢測(cè)到HCV NS3/4A基因序列還發(fā)生其他的堿基變異導(dǎo)致氨基酸替換，部分堿基的替換可能會(huì)引起反轉(zhuǎn)錄酶或蛋白酶分子的空間構(gòu)型發(fā)生改變，致使病毒對(duì)治療藥物的敏感性降低，導(dǎo)致HCV耐藥性的出現(xiàn)[22]。在抗病毒治療過(guò)程中，藥物選擇壓力可使耐藥病毒株迅速成為患者體內(nèi)主要病毒株，導(dǎo)致耐藥發(fā)生[22]。基因序列經(jīng)過(guò)進(jìn)化樹分析，提示河南省既往有償獻(xiàn)血HIV-1感染者中合并感染的HCV基因型以1b型為主，耐藥序列呈點(diǎn)狀散在分布，未發(fā)現(xiàn)聚集性?？赡艿脑?yàn)樵撌∮袃敨I(xiàn)血HIV-1感染者中合并HCV感染的時(shí)間較久，耐藥位點(diǎn)在感染者體內(nèi)自發(fā)突變，而非來(lái)自不同患者間的傳播。

總之，既往有償獻(xiàn)血感染HIV-1人群中合并感染的HCV對(duì)telaprevir和boceprevir存在天然耐藥，但耐藥水平處在較低狀態(tài)?？笻CV藥物在提高持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率、縮短療程、提高耐受性和降低耐藥危險(xiǎn)性方面還有很長(zhǎng)的路。

志謝非常感謝北京佑安醫(yī)院吳昊教授和夏煒老師的熱心幫助

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（2014-01-21收稿 2014-03-28修回）

（責(zé)任編委 張玲霞 本文編輯 陳玉琪）

Naturally occurring HCV resistance to telaprevir and boceprevir in previous paid blood donorsw ith HCV/HIV-1 co-infection

BAO Yi,TIAN Di,ZHENG Ying-ying,XIHong-li,LIU Dan,YU Min,XU Xiao-yuan*
Department of Infectious Diseases,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China
*Corresponding author,E-mail:yangpin@public3.bta.net.cn

Objective To analyze naturally occurring HCV resistance to telaprevir and boceprevir in previous paid blood donorswith HCV/HIV-1 co-infection,and provide basic data fordrugmonitoring and antiviral therapy for HCV.M ethods Plasma samples were collected from previous paid blood donors with HIV-1 infection,and HCV antibodies were detected.The HCV NS3/4A region was amplified using nested PCR,and drug resistance analysis was made by calculating resistance rate and assessing the prevalence of resistant strains.Results A total of 70(46.67%)fragments containing HCV NS3/4A region were successfully amplified from 150 samples.Drug resistance-related mutations were detected in 4(5.71%)patients,resistance to boceprevir in 2 patients (2.86%),with the resistance lociof R117H and A156V,and resistance to telaprevir in 2(2.86%)patients,with the resistance loci of R117H and A156V;possible resistance to telaprevir was found in 2(2.86%)patients,with the resistance locus of T54S.Previously reported resistance loci,such as V36A/M/L/C,Q41H/R,F43C/S,T54A,V55A,Q80R,R109K,S138C,R155G/I/K/M/T/Q/S,A156S/ T,D168A/E/G/H,V170A/T/I,N174G/S and L175M,were not detected.I35V,A40T,R62K,I64L,V71I,S66G,S91A and T42S exhibited a high replacement rate of over 90%.Phylogenetic analysis showed that drug resistance lociwere scatteredly distributed in the phylogeny tree,and no aggregation was detected.Conclusions HCV resistance to telaprevir and boceprevir occurs naturally in previous paid blood donorswith HCV/HIV-1 co-infection,with the resistance rates of 5.71%and 2.86%,respectively.Other loci exhibit highmutation rates,but no correlation with drug resistance is found.Moreover,no correlation is found among the resistant strains.

HCV;HIV;protease inhibitors;drug tolerance;blood donors

R373.21；R373.51

A

1007-8134(2014)03-0160-04

國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)（2012ZX10002003-004-003）；北京市科委2012年度科技計(jì)劃重大項(xiàng)目（D121100003912-003）

100034，北京大學(xué)第一醫(yī)院感染疾病科（鮑毅、田地、鄭穎穎、席宏麗、劉丹、于敏、徐小元）

徐小元，E-mail:yangpin@public3.bta.net.cn