基于分子信標(biāo)的DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)

劉 靜， 殷志祥

（安徽理工大學(xué) 理學(xué)院，安徽 淮南 232001）

文獻［1］首先建立了分子信標(biāo)技術(shù)，很快該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及分子生物學(xué)等諸多領(lǐng)域。分子信標(biāo)技術(shù)具有極高的特異性，操作簡單、靈敏度高，特別是在進行實時定量檢測、臨床診斷及基因檢測方面具有極強的優(yōu)勢。文獻［2－3］利用分子信標(biāo)構(gòu)造的可滿足性問題的DNA計算模型和文獻［4］基于分子信標(biāo)的邏輯門的計算模型對于分子信標(biāo)的研究具有重大意義；文獻［5－6］將分子信標(biāo)應(yīng)用于DNA計算中。

1 分子信標(biāo)技術(shù)的原理

分子信標(biāo)是一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈，一般有25～35個核苷酸。在結(jié)構(gòu)上，它是由環(huán)狀區(qū)、莖干區(qū)、熒光基團和淬滅基團組成。環(huán)狀區(qū)一般由15～30個核苷酸組成，并且可以與靶分子特異性結(jié)合。莖干區(qū)一般由5～8個堿基對組成，在分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合過程中可發(fā)生可逆性解離，而熒光基團一般是連接在5′端的，淬滅基團一般連在3′端。在自由狀態(tài)時，分子信標(biāo)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團和淬滅基團相距較近，然后發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使熒光基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被淬滅；當(dāng)分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合時，熒光基團與淬滅基團的距離變大時，熒光就會恢復(fù)，如圖1所示。

就目前的研究來看，如何找到更好的方法能夠最大限度地挖掘分子信標(biāo)表達和處理信息的能力、如何能找到分子信標(biāo)環(huán)部識別區(qū)長度與熒光顏色輕度或跟莖干的長度等之間的關(guān)系，從而尋找到信息容量更大、靈敏性更高、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、更加通用的分子信標(biāo)模型是進一步研究的重點。

圖1 分子信標(biāo)的原理

2 DNA自組裝

隨著DNA計算的逐步深入，DNA計算正逐步朝著自組裝方向發(fā)展，因為它極有可能成為下一代計算機的“圖靈機”。文獻［7］首次提出利用DNA分子構(gòu)成自組裝瓦片結(jié)構(gòu)；文獻［8］給出了求解累計異或運算的方法；文獻［9］將自組裝思想用于求解布爾邏輯運算；文獻［10］實現(xiàn)一維元胞自動機，后來又對DNA進行編碼，成功構(gòu)造出各種納米結(jié)構(gòu)［11］；文獻［12－14］提出了二維自組裝求解可滿足性問題的方法、非確定性算法、子集合問題等。以上研究主要是針對一維和二維的結(jié)構(gòu)展開的，對于三維的自組裝模型研究還處于起步階段［15－16］。

二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的自組裝在概念上是沒有區(qū)別的，二維結(jié)構(gòu)自組裝中運用的原理可以運用到三維結(jié)構(gòu)中。例如，文獻［17］合成了立方體和去角的八面體等納米結(jié)構(gòu)；文獻［18］構(gòu)建了DNA四面體、十二面體等，證明了DNA作為支架可以用來構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。

3 三維DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)

分子信標(biāo)技術(shù)本身具有簡單便捷、實時監(jiān)測、靈敏度高等特點，伴隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，不少研究人員也在考慮將該技術(shù)與其他相關(guān)的模型進行結(jié)合。諸如與鏈置換技術(shù)結(jié)合，進而可以有效地構(gòu)建DNA邏輯門［19］；與DNA變構(gòu)相結(jié)合，使得通過DNA分子的不同形態(tài)構(gòu)建可控的熒光納米裝置，隨著DNA分子的變構(gòu)，通過檢測熒光強度就能準(zhǔn)確了解DNA分子的構(gòu)象變化［20］；與某些酶切技術(shù)相結(jié)合，可以有效地進行檢測，有時比PCR檢測更具靈敏性［21］。這些技術(shù)的結(jié)合能夠讓兩者的優(yōu)勢都得以發(fā)揮，進而優(yōu)勢互補，可取得令人興奮的結(jié)果。

從自組裝的結(jié)構(gòu)來說，三維立體結(jié)構(gòu)相比于一維的線性結(jié)構(gòu)和二維的平面結(jié)構(gòu)在發(fā)展納米技術(shù)、藥物載體及DNA計算等方面都具有巨大的優(yōu)勢。文獻［22］將DNA自組裝和熒光技術(shù)相結(jié)合，利用DNA分子堿基互補配對，雜交后再用連接酶連接，得到了環(huán)鏈結(jié)構(gòu)。文獻［23］將DNA熒光技術(shù)應(yīng)用在檢測納米裝置的開關(guān)。這些三維結(jié)構(gòu)的嘗試對于DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)的發(fā)展都具有重大的意義。

在這些研究的基礎(chǔ)上，本文試圖探究一種穩(wěn)定性更高、產(chǎn)量更高的DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)。文獻［24］提出的關(guān)于納米DNA結(jié)構(gòu)中，DNA四面體的三維結(jié)構(gòu)是天然的“積木”，而且可以迅速地合成一個單一的立體異構(gòu)體，且具有產(chǎn)量高、三角架結(jié)構(gòu)的傳送穩(wěn)定性等特點?，F(xiàn)構(gòu)想DNA四面體的設(shè)計過程如圖2所示。首先組裝了3條短的DNA鏈和1個分子信標(biāo)，6對互補域（圖中相同標(biāo)號部分）雜交成6條邊。每條鏈包含3個區(qū)域并且運行1周。在該DNA的骨架中，5′和3′端都有一個缺口，給予適宜的條件，分子信標(biāo)會找到其靶分子，最后會形成圖2b和圖2c所示的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在該結(jié)構(gòu)中5條邊是20個堿基互補配對的雙螺旋結(jié)構(gòu)，并且其長度為6.8nm，第6條邊的長度為3.4nm，它包含10個堿基，與分子信標(biāo)結(jié)合后形成4個堿基的發(fā)夾環(huán)和12個核苷酸的環(huán)域。

圖2 DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)

組裝四面體的過程是將其放在含鹽的緩沖液中，加熱至95℃，再冷卻至室溫，此時要特別注意退火的溫度，保證分子信標(biāo)與DNA鏈雜交，要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的其他3條鏈都進行磷酸酸化，再用T4DNA連接酶處理后，就會發(fā)生自組裝反應(yīng)。首先讓分子信標(biāo)與其他3條鏈進行反應(yīng)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)是可以重構(gòu)的，當(dāng)發(fā)夾形成閉合狀態(tài)時，含有5個堿基配對的鏈和分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖就會形成1個缺口，并進一步形成發(fā)夾循環(huán)，該過程的能量是由12個核酸雜交所釋放的。在圖2d中表示的是由2個缺口的2條連續(xù)的30個堿基互補配對的雙鏈。作為釋放能量的分子信標(biāo)的核酸是沒有與四面體形成的復(fù)合物雜交的。圖2b、圖2c和圖2d演示了四面體打開和閉合的發(fā)夾模型。還可以采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）來觀察并檢驗其重構(gòu)性，確定發(fā)夾循環(huán)是正確形成的，如圖3所示。

圖3 PAGE演示分析移動性閉合狀態(tài)和打開狀態(tài)

4 三維結(jié)構(gòu)的應(yīng)用

上述結(jié)合分子信標(biāo)的自組裝三維結(jié)構(gòu)不僅有圖像結(jié)構(gòu)信息，而且最重要的是可以隨著結(jié)構(gòu)的變化應(yīng)用于納米技術(shù)、藥物載體和DNA計算等方面。在DNA計算方面，關(guān)于立體結(jié)構(gòu)應(yīng)用方面的研究相對較少，但是可以從其獨特的優(yōu)勢，看出它適合解決NP難的問題，因為其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)可以縮短自組裝的時間、空間復(fù)雜度、生物酶的使用量，從而提高實驗成功率和精確度。將它運用于邏輯運算［25－27］，并將其整合制作成 DNA芯片，利用其高效并行的計算能力，推動DNA計算機的發(fā)展。

布爾邏輯運算得名于英國數(shù)學(xué)家喬治·布爾，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于電子學(xué)、計算機軟件和硬件中，在計算機中用布爾邏輯運算定義一些布爾邏輯函數(shù)，即操作符。每個函數(shù)可以根據(jù)1個或多個輸入，用邏輯算法來得到輸出值（真值為1，假值為0）。因此，邏輯運算具有重要的意義。

本文擬在分子維度方面利用上述立體結(jié)構(gòu)解決簡單布爾邏輯表達式的求值問題，現(xiàn)利用該立體結(jié)構(gòu)設(shè)計構(gòu)建“and”門和“or”門，主要包括的工作有：①DNA自組裝模型結(jié)構(gòu)的設(shè)計、信號傳入和識別、輸出信息；② 總體上的設(shè)計，包括在該過程中溫度的控制、溶液濃度的控制、酶的使用量以及防止錯配等問題。

利用立體結(jié)構(gòu)自組裝and邏輯門，如圖4所示。它的5條邊是20個堿基互補配對的雙螺旋結(jié)構(gòu)，長度為6.8nm，第6條邊的長度是3.4nm，包含10個堿基。在運行過程中，自DNA鏈放入鹽酸溶液中后，需要加熱至95℃，冷卻，加入分子信標(biāo)，再開始加入需要識別的信號溶液1和2，幾分鐘后即可檢測到熒光，檢測得到熒光后加熱，3條鏈和分子信標(biāo)會分離，回到最初的狀態(tài)。

圖4 自組裝and邏輯門

類似地，自組裝“or”邏輯門也可以采用相同的方式進行。在選擇的過程中，只要有1個值為“真”，即可成立。示意圖如圖5所示。

圖5 自組裝or邏輯門

在上述and和or邏輯門的基礎(chǔ)上，本文可以做復(fù)雜的邏輯運算，為不失一般性，選取的合取范式如下：

具體運算過程如圖6所示，其實驗方法如下：分別計算每個子句的值；利用自組裝自底向上的特點，再分別計算次子句的值；計算出整個邏輯運算W的值。應(yīng)用上述立體結(jié)構(gòu)，本文首先構(gòu)造DNA鏈，讓其進行第1層的子句運算，因為三維結(jié)構(gòu)本身就具有多個變量同時計算的特點，在本例中只需3步即可得到結(jié)果。

將DNA鏈放在含鹽的緩沖液中，加熱至95℃，冷卻至室溫，再加入分子信標(biāo)，然后進行磷酸酸化，保證發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，再用T4DNA連接酶進行處理?？梢栽诓煌膮^(qū)域檢測到3處熒光，還有一部分并未形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。再進行一次上述處理后進行檢測，沒有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。綜上所述，可以得到W＝0。

應(yīng)用該結(jié)構(gòu)，不僅可以簡化二維結(jié)構(gòu)中的多次運算，而且由于它可以重構(gòu)而反復(fù)使用，具有一定的實際價值。

圖6 DNA自組裝自下而上的運算過程

5 結(jié)束語

本文利用已有的分子信標(biāo)技術(shù)和DNA自組裝模型的研究成果，主要研究了一種DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)——帶有分子信標(biāo)的DNA四面體，它能夠完成自行裝配，且實驗操作簡單。另外，該模型也為相關(guān)領(lǐng)域（如計算機科學(xué)、密碼學(xué)及納米智能等）提供了新的思路和結(jié)合點。隨著三維DNA自組裝模型的深入研究，DNA計算在未來的實際應(yīng)用中必將發(fā)揮重大作用。

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