大黃素聯(lián)用吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3裸鼠移植瘤的抑制作用

魏為添，劉殿雷

（1.浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤外科，杭州 310000；2.杭州市中醫(yī)院）

大黃素聯(lián)用吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3裸鼠移植瘤的抑制作用

魏為添1，劉殿雷2

（1.浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤外科，杭州 310000；2.杭州市中醫(yī)院）

目的探討大黃素增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3裸鼠移植瘤的促凋亡作用及其可能的作用機(jī)制。方法在培養(yǎng)人胰腺癌Bxpc-3細(xì)胞的基礎(chǔ)上建立荷瘤模型，荷瘤裸鼠用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分配方法分為四組：0.9%氯化鈉注射溶液組（N組）：腹腔注射0.9%氯化鈉注射溶液0.2 mL，大黃素組（E組，40 mg／kg），吉西他濱組（G組，125 mg／kg），聯(lián)合組（E+G組，大黃素40 mg／kg和吉西他濱80 mg／kg）。用藥均采用腹腔注射。用藥過程觀測(cè)裸鼠體質(zhì)量、腫瘤體積和瘤重的變化。用免疫組織化學(xué)染色法來(lái)檢測(cè)移植瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白NF-κB、Bcl-2和Active caspase 3表達(dá)的變化。結(jié)果給藥結(jié)束后，吉西他濱組的裸鼠平均體質(zhì)量和對(duì)照組相比顯著減小，而聯(lián)合組中裸鼠平均體質(zhì)量和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；聯(lián)合組移植瘤平均體積和瘤重均明顯比其他組??；E+G組的NF-κB、Bcl-2的表達(dá)與其余各組比較均明顯降低，聯(lián)合組中的Active caspase 3的表達(dá)和其余各組相比明顯增多。結(jié)論大黃素可顯著提高吉西他濱對(duì)Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，其作用機(jī)制可能為大黃素抑制凋亡抑制基因NF-κB、Bcl-2的表達(dá)從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。

胰腺腫瘤；細(xì)胞凋亡；大黃素；抗腫瘤藥；小鼠，裸

圖1 本研究材料和方法中所描述的實(shí)驗(yàn)方案示意圖

圖2 各組腫瘤平均體積變化曲線

圖4 末次給藥后1周各組瘤體中NF-k B、Bcl-2和Active caspase-3的表達(dá)變化(免疫組織化學(xué)染色法,1O×4O)

胰腺癌起病隱匿，早期診斷困難，90%的患者確診時(shí)已是晚期，外科手術(shù)切除率低。目前化學(xué)藥物治療是臨床上治療胰腺癌的主要重要手段之一。吉西他濱仍被認(rèn)為是晚期胰腺癌標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，但是許多研究顯示吉西他濱單藥的療效有限，且有明顯副作用。大黃素（1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，EM）是一種蒽醌類物質(zhì)，研究表明大黃素能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡［1-3］。本研究旨在探討動(dòng)物體內(nèi)大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)荷瘤裸鼠胰腺癌細(xì)胞的促凋亡作用并探討兩藥聯(lián)合使用的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌Bxpc-3細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)（ATCC），BXPC-3細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清、100 u／mL青霉素和100 u／mL鏈霉素的RPMI1640，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～7周齡BALB／c nu／nu雌性裸小鼠（體質(zhì)量20～22 g），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。大黃素（批號(hào)：E7881）購(gòu)自美國(guó)sigma公司。吉西他濱（批號(hào)：A629519A）購(gòu)自法國(guó)禮來(lái)公司。兔抗人NF-κB多克隆抗體、兔抗人BCL-2多克隆抗體和兔抗人Active caspase 3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 胰腺癌荷瘤裸鼠模型建立和實(shí)驗(yàn)方案 將Bxpc-3細(xì)胞懸液注射于裸小鼠背部靠近后肢部位皮下，每只鼠約注射2×106個(gè)細(xì)胞。3周后，待裸鼠移植瘤長(zhǎng)徑均≥5 mm后，以移植瘤長(zhǎng)短徑計(jì)算瘤體相似體積。按腫瘤體積的大小來(lái)順排，用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分配方法將裸鼠分為4組，分別為對(duì)照組（N：注射0.9%氯化鈉注射溶液）、大黃素組（E組：40 mg／kg）、吉西他濱組（G組：125 mg／kg）和聯(lián)合組（E+G組：吉西他濱80 mg／kg+大黃素40 mg／kg），每組12只。分組后經(jīng)腹腔注射給藥，3 d／次，總共11次，用藥結(jié)束后1周即用藥開始后第37天時(shí)將裸鼠處死。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的測(cè)量與處理 從用藥開始6 d測(cè)量一次裸鼠的體質(zhì)量，每次以臨用藥前所測(cè)體質(zhì)量進(jìn)行用藥，同時(shí)以游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤的大小，包括長(zhǎng)徑a和短徑b（mm），計(jì)算皮下移植瘤的相似體積，體積（V）＝4／3×π×r3，r＝（a+ b）／4。裸鼠處死之前檢測(cè)瘤體體積和裸鼠體質(zhì)量，共測(cè)7次瘤體體積和裸鼠體質(zhì)量。抑瘤率＝［1-（治療組分組時(shí)平均瘤體體積 -實(shí)驗(yàn)結(jié)束后平均瘤體體積）／（對(duì)照組分組時(shí)平均瘤體體積-實(shí)驗(yàn)結(jié)束后平均瘤體體積）］×100%。繪制各組裸鼠體質(zhì)量的變化曲線和瘤體體積的變化曲線。處死裸鼠后剝?nèi)×鰤K以稱取瘤重和拍照，比較治療后腫瘤大小。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白NF-κB、Bcl-2和Active caspase-3的表達(dá) 常規(guī)固定、包埋后，取石蠟切片脫蠟水化，按照免疫組織化學(xué)二步法試劑盒所示操作步驟進(jìn)行染色，圖片結(jié)果在顯微鏡下拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件來(lái)進(jìn)行分析平均吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件ANOVA方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠體質(zhì)量變化 從開始用藥當(dāng)天開始每6天測(cè)量1次裸鼠體質(zhì)量，末次用藥后1周再測(cè)量1次，前后共測(cè)量7次（圖1）。末次用藥后1周，各組裸鼠平均體質(zhì)量大小為：E組［（17.3±0.57）g］＞N組［（17.1±0.48）g］＞E+G組［（16.5± 0.39）g］＞G組［（13.2±0.41）g］，G組與其他各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組平均瘤體體積（圖2，3）、瘤重及抑瘤率裸鼠分組時(shí)各組裸鼠的平均瘤體體積是（0.40±0.09）cm3，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。末次給藥后1星期，檢測(cè)并計(jì)算各組平均瘤體及瘤重大?。簩?duì)照組平均瘤體體積是（2.19±0.16）cm3；瘤重（2.23±0.27）g。大黃素組平均瘤體體積是（1.66±0.11）cm3，瘤重（1.76±0.20）g抑瘤率是30.7%。吉西他濱組的瘤體平均體積為（1.18± 0.12）cm3，瘤重（1.24±0.12）g，抑瘤率是57.6%。聯(lián)合組平均瘤體體積為（0.53±0.08）cm3，瘤重（0.56±0.08）g，抑瘤率是93.9%。和對(duì)照組比較，吉西他濱組與大黃素組的平均瘤體體積和瘤重均明顯小于對(duì)照組（P＜0.05），但聯(lián)合組抑制腫瘤的作用更為明顯，和其余各組相比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 免疫組織化學(xué)分析大黃素、吉西他濱對(duì)裸鼠移植瘤BXPC-3細(xì)胞中凋亡相關(guān)的蛋白NF-κB、Bcl-2、Active caspase-3表達(dá)的影響（圖4） 末次給藥后一周剖取裸鼠移植瘤組織，經(jīng)用免疫組織化學(xué)法染色后測(cè)量各組瘤體組織平均吸光度，見對(duì)照組瘤體細(xì)胞質(zhì)有大量NF-κB、Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)；吉西他濱組中NF-κB、Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)比對(duì)照組稍增多，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而大黃素組（E組）Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組明顯變少（P＜0.05）；而聯(lián)合組（E +G組）中NF-κB、Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)比對(duì)照組與吉西他濱組均要明顯減少（P＜0.05）。

3 討論

細(xì)胞凋亡的受阻和腫瘤發(fā)生、發(fā)展有很密切的關(guān)系。通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、提高腫瘤對(duì)化療藥物治療的敏感性乃是目前治療惡性腫瘤的一個(gè)重要治療策略。Guo［2］、Cai［4］等人通過研究發(fā)現(xiàn)大黃素有誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的效果。而Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，其中Caspase為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了四組標(biāo)本中活化的Caspase-3（17KD），結(jié)果顯示，大黃素和吉西他濱都能使Active Caspase-3（17KD）表達(dá)增多，聯(lián)合用藥時(shí)Active Caspase-3（17KD）表達(dá)比單獨(dú)用藥均顯著增多，提示聯(lián)合用藥使Caspase-3激活而使更多的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段。

腺癌中存在NF-κB的表達(dá)和激活，并認(rèn)為NF-κB的表達(dá)是胰腺癌化療耐藥的原因之一［5-7］。本實(shí)驗(yàn)表明胰腺癌中存在NF-κB的表達(dá)。抑制NF-κB的表達(dá)能增強(qiáng)多種化療藥物的抗腫瘤作用［8-9］。Fahy等［10］研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能上調(diào)NF-κB和其調(diào)控的Bcl-2啟動(dòng)因子活性，因?yàn)榛罨腘F-κB促進(jìn)有絲分裂和抗凋亡，進(jìn)而引起胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥。因此，吉西他濱耐藥與NF-κB和其下游基因產(chǎn)物Bcl-2過表達(dá)相關(guān)，提示NF-KB是逆轉(zhuǎn)耐藥的靶點(diǎn)。研究表明大黃素可下調(diào)細(xì)胞NF-κB表達(dá)［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱可使胰腺癌NF-κB表達(dá)增加，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與吉西他濱用藥時(shí)間仍然較短有關(guān)，但大黃素、大黃素聯(lián)合吉西他濱顯著下調(diào)胰腺癌中NF-κB的表達(dá)，提示大黃素可能通過抑制NF-κB的表達(dá)，而發(fā)揮對(duì)胰腺癌細(xì)胞促凋亡作用。Bcl-2是NF-κB的靶基因，Kunnumakkara［13］、Kong［14］等均報(bào)道可以通過NF-κB的下調(diào)而使Bcl-2下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱可使胰腺癌中Bcl-2表達(dá)增加，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而大黃素組明顯下調(diào)移植瘤細(xì)胞Bcl-2表達(dá)；大黃素可能通過下調(diào)胰腺癌細(xì)胞NF-κB表達(dá)，從而下調(diào)Bcl-2，通過Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)最后促使Caspase-3的激活，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡增多，達(dá)到增強(qiáng)吉西他濱對(duì)sw1990細(xì)胞移植瘤的促凋亡作用。

吉西他濱用于胰腺癌化療時(shí)毒副作用較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用藥結(jié)束后吉西他濱治療后荷瘤裸鼠體質(zhì)量與其他各組相比均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而大黃素與吉西他濱聯(lián)合組裸鼠體質(zhì)量較吉西他濱治療組大，提示在降低吉西他濱用劑量的基礎(chǔ)上，聯(lián)用大黃素能增加療效并減少毒副作用。

本實(shí)驗(yàn)表明，大黃素聯(lián)用吉西他濱能增加吉西他濱對(duì)胰腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用，其機(jī)制與大黃素可下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白NF-κB、Bcl-2的表達(dá)來(lái)增加吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的促凋亡作用有關(guān)。

（本文圖1～4見插圖6-1）

［1］ Su YT，Chang HL，Shyue SK，et al.Emodin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species-dependent mitochondrial signaling pathway［J］.Biochem Pharmacol，2005，70（2）：229-241.

［2］ Guo Q，Chen Y，Zhang B，et al.Potentiation of the effect of gemcitabine by emodin in pancreatic cancer is associated with survivin inhibition［J］.Biochem Pharmacol，2009，77（11）：1674-1683.

［3］ Lin SY，LaiWW，Ho CC，et al.Emodin induces apoptosis of human tongue squamous cancer SCC-4 cells through reactive oxygen species and mitochondria-dependent pathways［J］.Anticancer Res，2009，29（1）：327-335.

［4］ Cai J，Razzak A，Hering J，et al.Feasibility evaluation of emodin（rhubarb extract）as an inhibitor of pancreatic cancer cell proliferation in vitro［J］.JPEN，2008，32（2）：190-196.

［5］ Arlt A，Schafer H.NFkappaB-dependent chemoresistance in solid tumors［J］.Int JClin Pharmacol Ther，2002，40（8）：336-347.

［6］ Liptay S，Weber CK，Ludwig L，et al.Mitogenic and antiapoptotic role of constitutive NF-kappaB／Rel activity in pancreatic cancer［J］.Int JCancer，2003，105（6）：735-746.

［7］ Holcomb B，Yip-Schneider M，Schmidt CM.The role of nuclear factor kappaB in pancreatic cancer and the clinical applications of targeted therapy［J］.Pancreas，2008，36（3）：225-235.

［8］ Banerjee S，Zhang Y，Wang Z，et al.In vitro and in vivomolecular evidence of genistein action in augmenting the efficacy of cisplatin in pancreatic cancer（vol 120，pg 906，2007）［J］.Int JCan，2014，134（8）：E4-E4.

［9］ Ali S，Varghese L，Pereira L，et al.Sensitization of squamous cell carcinoma to cisplatin induced killing by natural agents［J］.Cancer Letters，2009，278（2）：201-209.

［10］Fahy BN，Schlieman MG，Virudachalam S，etal.Inhibition of AKT abrogates chemotherapy-induced NF-kappaB survivalmechanisms：implications for therapy in pancreatic cancer［J］.JAm Coll Surg，2004，198（4）：591-599.

［11］Chen GL，Liu ZY，Wang J，etal.Protective effectof emodin against lipopolysaccharides-induced corneal injury in rats［J］.Chin Med Sci J，2009，24（4）：236-240.

［12］Li HL，Chen HL，Li H，et al.Regulatory effects of emodin on NF-kappaB activation and inflammatory cytokine expression in RAW 264.7 macrophages［J］.Int JMol Med，2005，16（1）：41-47.

［13］Kunnumakkara AB，Guha S，Krishnan S，et al.Curcumin potentiates antitumor activity of gemcitabine in an orthotopic model of pancreatic cancer through suppression of proliferation，angiogenesis，and inhibition of nuclear factor-kappaB-regulated gene products［J］.Cancer Res，2007，67（8）：3853-3861.

［14］Kong R，Sun B，Jiang H，et al.Downregulation of nuclear factor-kappaB p65 subunit by small interfering RNA synergizeswith gemcitabine to inhibit the growth of pancreatic cancer［J］.Cancer Lett，2010，291（1）：90-98.

Emodin enhances gem citabine-induced apoptosis in pancreatic cancer model of Bxpc-3 cell xenograft in nude mice through the downregulation of Bcl-2

WEIWeitian，LIU Dianlei（Department of General Surgery，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310000，China）

LIU Dianlei，Email：ldl0304＠163.com

ObjectiveTo investigate the enhanced gemcitabine-induced apoptosis by emodin and the possible therapeuticmechanism.MethodsHuman pancreatic carcinoma Bxpc-3 cellswere cultured and themurine xenograftmodel bearing human pancreatic carcinoma was established.Then the mice were randomly divided into control group，emodin group，gemcitabine group and emodin combined with gemcitabine group.Body weightofmice、the tumor volume and tumor weightweremeasured during the study.And Immunohistochemistry（IHC）was used to detect the variance of the apoptotsis relative protein expression such as NF-κB、Bcl-2 and Active caspase 3.ResultsAfter the last administrations，the average weight of nudemice in gemcitabine group decreased significantly compared with the control group，and the nudemiceweight in the combined therapy group had no significant decrease compared with the control group.And themean tumor volume and tumor weight in combined administration group was significantly decreased compared to the other groups.Immunohistochemistry（IHC）analysis showed the expression of NF-κB、bcl-2 proteins was significantly decreased in the combined administration group compared to the other gourps.Active caspase 3 was significantly increased compared to the other gourps.ConclusionEmodin can enhance the antitumor effect of gemcitabine in the growth of the xenografts of human pancreatic cancer Bxpc-3 cells in nude mice，whose mechanismsmay be related to the downregulation of NF-κB and Bcl-2.

Pancreatic neoplasms；Apoptosis；Emodin；Antineoplastic agents；Mice，nude

R735.9

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.019

2014-09-30）

浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金資助項(xiàng)目（2013ZQ026）

魏為添，醫(yī)師，Email：wwtlhy＠163.com

劉殿雷，醫(yī)師，Email：ldl0304＠163.com