地黃低聚糖對過氧化氫-血清饑餓誘導的脂肪組織來源干細胞凋亡的影響

裴志勇，趙玉生，高偉，尹巧香

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京 100700；2.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所；3.空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科）

地黃低聚糖對過氧化氫-血清饑餓誘導的脂肪組織來源干細胞凋亡的影響

裴志勇1，趙玉生2，高偉2，尹巧香3

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科，北京 100700；2.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所；3.空軍總醫(yī)院干部病房心內(nèi)科）

目的探討地黃低聚糖（RGOs）對過氧化氫-血清饑餓誘導的脂肪組織來源干細胞（ASCs）凋亡的影響。方法過氧化氫（200μM）聯(lián)合血清饑餓（H2O2／SD，6 h）建立小型豬ASCs凋亡模型。RGOs（0.01 g／L、0.1 g／L、1 g／L、10 g／L）預處理12h并繼續(xù)干預6 h。Annexin V-FITC／PI檢測細胞凋亡率，CCK-8法測定細胞活性，酶標儀比色法測定細胞caspase-3的活性。結(jié)果RGOs在一定濃度范圍（0.1～10 g／L）可以減輕H2O2／SD引起的ASCs損傷，表現(xiàn)在細胞凋亡率下降，細胞活性增加，caspase-3活性降低。結(jié)論地黃低聚糖對過氧化氫-血清饑餓誘導的脂肪組織來源干細胞的凋亡具有保護作用。

干細胞；細胞凋亡；地黃屬；豬

干細胞移植治療急性心肌梗死是心血管再生領域研究的熱點，但由于心肌缺血、缺氧造成的氧化應激環(huán)境（活性氧蓄積、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏）可致心肌細胞及移植干細胞大量凋亡，嚴重阻礙了干細胞移植療效的發(fā)揮?？梢?，改善局部心肌惡劣的微環(huán)境是減少心肌細胞凋亡，提高干細胞存活率的關鍵所在。地黃低聚糖（RGOs）系從地黃中分離提取的一種多糖成分，其在血液、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等方面具有廣泛的藥理作用，但對于其是否具有抗凋亡作用研究較少。本研究擬采用過氧化氫（H2O2）聯(lián)合血清饑餓（SD）模擬AMI后局部心肌氧化應激的微環(huán)境，誘導體外培養(yǎng)的小型豬ASCs損傷，觀察不同濃度RGOs對ASCs凋亡的影響。

地黃低聚糖對過氧化氫-血清饑餓誘導隨脂肪組織來源千細胞凋亡隨影響

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

1 材料與方法

1.1 材料 L-DMED培養(yǎng)基、特級胎牛血清（FBS）、Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶均購自Gibco公司，DispaseⅡ中性蛋白酶、Hoechst 33258購自Sigma公司，小鼠抗CD31、CD90單克隆抗體均購自BD PharmingenTM公司，小鼠抗CD29、CD45、CD105、HLA-DR單克隆抗體、大鼠抗CD44單克隆抗體均購自Abcam公司，大鼠抗CD34單克隆抗體購自Santa cruz公司。30%過氧化氫溶液購自北京化工廠，多聚甲醛購自天津市光復精細化工研究所，Ho-echst 33258購自Sigma公司，Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒、羅丹明123、CCK-8試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。廣西巴馬小香豬，雌雄不拘，體質(zhì)量20 kg～30 kg，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（軍）2007-009。二氧化碳孵箱（美國Thermo scientific公司），普通光學顯微鏡（德國Leica DM IL），倒置相差顯微鏡（日本Olympus BX51），熒光顯微鏡（德國Leica DM IRB），流式細胞儀（美國Bec km an Coulter CYTOMICSFC 500），低溫離心機（美國Sigma 3K18），紫外線分光光度計（美國Bec km an），酶標儀（上海Multiscan MK3）。

1.2 方法

1.2.1 小型豬ASCs的分離與培養(yǎng) 無菌條件下取小型豬腹股溝區(qū)脂肪組織5～8 g，冰PBS沖洗3次，去除血污、筋膜及血管，剪碎呈糊狀；加入20 mL消化液（L-DMEM＋0.1%Ⅳ型膠原酶＋0.1%DispaseⅡ中性蛋白酶＋0.1%胰蛋白酶），置于37℃孵箱振蕩消化40～60 min；加入等量含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，100目、200目篩網(wǎng)過濾，600 g離心6 min；棄上清，加入含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，移入培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，隨后每2～3天換液1次。約1周細胞融合80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA溶液消化、傳代。倒置顯微鏡觀察原代及傳代的ASCs形態(tài)學特點。

1.2.2 小型豬ASCs的分子表型鑒定 取第4代細胞，0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA溶液消化后PBS重懸細胞并計數(shù)，細胞密度調(diào)至1×106／mL；取9只EP管，分別加入0.5 mL細胞懸液，1000 r／min離心5 min，PBS清洗兩遍；0.5 mL PBS再次重懸細胞，加入以下抗體：CD29-FITC、CD31-PE、CD34（一抗）、CD44-FITC、CD45（一抗）、CD90-FITC、CD105-FITC、HLA-DR-FITC（對照加入20μl PBS），混勻后4℃冰箱靜置30 min；1900 r／min離心8 min，棄上清；CD34及CD45兩只EP管的細胞再次用0.5 mL PBS重懸，加入二抗（均為FITC），混勻后4℃冰箱靜置30 min，1900 r／min離心8 min，棄上清；各管均加入2%多聚甲醛0.5 m L，4℃固定30 min。流式細胞儀進行陽性細胞計數(shù)，每次分析獲取2×104個細胞，Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗重復3次。

1.2.3 實驗分組 取同一代ASCs，待細胞融合70%～80%時隨機分為以下6組：①對照組（Control），無特殊干預；②RGOs 0 g／L＋H2O＋2／SD＋；③RGOs 0.01 g／L＋H2O＋2／SD＋；④RGOs 0.1 g／L＋H2O＋2／SD＋；⑤RGOs 1 g／L＋H2O＋2／SD＋；⑥RGOs 10 g／L＋H2O＋2／SD＋。對照組繼續(xù)正常培養(yǎng)，其余分組提前加入不同終濃度的RGOs預處理12 h，其后均更換無血清L-DMEM培養(yǎng)基，同時加入相同預處理濃度的RGOs及終濃度為200μM的H2O2（該濃度根據(jù)H2O2／SD凋亡模型建立時而定）［1］。作用6 h后收集細胞進行相關檢測。

1.2.4 細胞核形態(tài)學觀察 各組細胞棄上清液，PBS清洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min。棄固定液后PBS清洗兩遍，加入終濃度為5μg／m l Hoechst 33258染色液，室溫30 min。熒光顯微鏡下觀察各組細胞核染色質(zhì)形態(tài)學變化，判斷細胞凋亡情況并計數(shù)，計算細胞凋亡率。即高倍視野（×400）各組計數(shù)至少300個細胞，細胞凋亡率＝凋亡細胞數(shù)／細胞總數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.2.5 細胞活性檢測 取同一代ASCs細胞種植于96孔板，待細胞融合70%～80%時隨機分為6組（同“1.2.3”分組），進一步處理方法“1.2.3”，同時設單純無血清L-DMED為空白對照，每組設5個復孔，終止培養(yǎng)后，每孔加入10μL CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定各孔OD450值。各組取5孔OD值的平均數(shù)，減去空白對照平均OD450值作為各組實測值，按公式計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝處理組實測OD450／對照組實測OD450×100%。實驗重復3次。

1.2.6 細胞膜磷酯酰絲氨酸（PS）及線粒體內(nèi)跨膜電位檢測 收集各組細胞，分為兩份，一份用400 μL PBS重懸，加入終濃度為1μM羅丹明（Rhodamine）123，37°C孵育30 min，流式細胞儀檢測線粒體膜電位；另一份細胞PBS重懸后1000 g離心5 min，棄上清；加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10min；1000 g離心5 min，棄上清，加入190μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞；加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min；加入200μL PBS后流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡（Annexin V＋／PI-）、晚期凋亡（Annexin V＋／PI＋）及死亡率（Annexin V-／PI＋），細胞計數(shù)2×104。實驗重復3次。

1.2.7 Caspase-3活性檢測 根據(jù)試劑盒說明測定4-硝基苯胺（p NA）的標準曲線。收集各組細胞，PBS洗滌一次，吸盡上清；按照每1×106細胞加入50μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4℃18 000 g離心15 min；把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預冷的離心管中，根據(jù)試劑盒設置反應體系測定caspase-3的酶活性。37℃孵育60～120 min，酶標儀上測定各孔405 nm波長光密度值（OD405）。每組重復3孔，取平均值作為該組OD405，根據(jù)標準曲線計算各組p NA含量，即該組caspase-3的酶活力單位數(shù)。另取10μL上清液Bradford法測定各樣品中蛋白濃度，計算出單位質(zhì)量蛋白中所含的caspase-3的酶活力單位數(shù)。caspase-3活性＝各組caspase-3酶活力單位數(shù)／對照組caspase-3酶活力單位數(shù)。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。多組之間比較先采用F檢驗，后采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小型豬ASCs形態(tài)學觀察 原代細胞接種24 h后首次換液，可見大量貼壁細胞，多呈圓形或橢圓形，少數(shù)呈梭形、三角形或多角形，有粗大突起，核居中，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量大小不等透明圓泡及細小顆粒。72 h后，細胞較前伸展變大，形狀如前。7 d左右細胞融合達80%～90%，可按1∶3傳代。傳代后的細胞數(shù)小時可完全貼壁，生長較迅速，5 d左右可再次傳代。2～3次傳代后細胞多呈三角形、多角形或星形。

2.2 ASCs表面抗原表達 第4代ASCs表面抗原表達率如下：CD29［（99.07±0.28）%］、CD44［（98.83±0.56）%］、CD90［（97.60±0.44）%］、CD105［（99.31±0.48）%］、CD31［（1.95±0.05）%］、CD34［（2.33±0.37）%］、CD45［（1.94±0.04）%］、HLA-DR［（0.35±0.02）%］。提示第4代ASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈陰性。

2.3 細胞凋亡核形態(tài)學變化及凋亡率 根據(jù)熒光顯微鏡下細胞核染色質(zhì)形態(tài)學變化計算出各組細胞凋亡率分別為：（6.4±0.7）%，（24.9±3.6）%，（18.2±3.5）%，（11.6±3.3）%，（11.5±3.2）%，（15.6±3.1）%。統(tǒng)計分析顯示，單純H2O2／SD組（RGOs 0 g／L）細胞凋亡率明顯多于對照組（P＜0.01），RGOs不同濃度組（0.01～10 g／L）細胞凋亡率較單純H2O2／SD組均有不同程度下降（P＜0.05～0.01）；其中0.1 g／L組及1 g／L組細胞凋亡率最低。

2.4 細胞活性檢測 以對照組為參照，計算出0～10mg／mL不同濃度RGOs組細胞存活率分別為：（52.4±4.2）%，（56.1±5.2）%，（74.3±6.8）%，（84.3±5.7）%，（79.7±7.8）%。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，單純H2O2／SD組細胞存活率低于對照組（P＜0.01），RGOs0.1～10mg／mL組細胞存活率較單純H2O2／SD組均有顯著提高（P＜0.01），而0.01mg／mL組細胞存活率較單純H2O2／SD組無明顯提高。

2.5 膜聯(lián)蛋白V法（Annexin V）檢測細胞凋亡

如圖1所示流式細胞儀所測各組細胞凋亡及壞死。以H2O2／SD＋RGOs各組與對照組細胞早期凋亡率（Annexin V＋／PI-）、晚期凋亡率（Annexin V＋／PI＋）及壞死率（Annexin V-／PI＋）的比值作為各組凋亡指數(shù)及壞死指數(shù)（表1）。統(tǒng)計分析顯示，單純H2O2／SD組細胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死指數(shù)均明顯高于對照組（P＜0.01）；不同濃度RGOs干預后，0.1 g／L、1 g／L、10 g／L三組細胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死指數(shù)均明顯低于單純H2O2／SD組（P＜0.05～0.01）；而0.01 g／L組以上各指標無明顯下降，且均高于對照組（P＜0.05～0.01）。

2.6 Caspase-3活性檢測 以H2O2／SD＋RGOs各組（0 g／L、0.01 g／L、0.1 g／L、1 g／L、10 g／L）與對照組caspase-3酶活力單位數(shù)的比值作為各組caspase-3活性。各組caspase-3活性依次為：1±0、3.36±0.29、3.12±0.27、1.98±0.14、1.84±0.1、1.97±0.13。統(tǒng)計分析顯示，單純H2O2／SD組caspase-3活性明顯高于對照組（P＜0.01）；不同濃度RGOs干預后，0.1～10 g／L組caspase-3活性均明顯低于單純H2O2／SD組（P＜0.01），而0.01 g／L組caspase-3活性無明顯下降（P＞0.05）。

3 討論

細胞凋亡時發(fā)生獨特的形態(tài)學變化，如核染色質(zhì)凝聚、邊集，細胞膜的發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體形成。本研究在熒光顯微鏡下觀察到了H2O2／SD誘導ASCs凋亡時典型的核形態(tài)學變化，并根據(jù)Hoechst 33258染色后細胞核染色質(zhì)的變化進行凋亡細胞計數(shù)，判斷不同濃度RGOs對H2O2／SD損傷的影響。結(jié)果顯示0.1 g／L、1 g／L及10 g／L濃度組ASCs凋亡率明顯下降，提示RGOs具有抗H2O2／SD引起的細胞凋亡作用，最適濃度是0.1～1 g／L。初步證實RGOs具有抗凋亡作用。

表1 各組凋亡指數(shù)、壞死指數(shù)比較（s）

表1 各組凋亡指數(shù)、壞死指數(shù)比較（s）

注：與對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與0 g／L比較，cP＜0.01，dP＜0.05

組別培養(yǎng)皿數(shù)（個）早期凋亡指數(shù)晚期凋亡指數(shù)壞死指數(shù)對照組1±0 1±0 1±0 RGOs 0 g／L 3 3.61±0.77a3.64±0.88a3.89±1.06aRGOs 0.01 g／L 3 2.71±0.52b2.9±0.31a2.81±1.06bRGOs 0.1 g／L 3 1.83±0.62c1.91±0.47c1.90±0.45dRGOs 1 g／L 3 1.65±0.36c1.74±0.20c1.58±0.09cRGOs 10 g／L 3 2.05±0.56d2.14±0.37c2.08±0.31 3 d

Annexin V聯(lián)合碘化丙啶（PI）檢測法可將細胞分為正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞［2］。正常細胞Annexin V及PI均為陰性，而凋亡細胞呈Annexin-V強陽性、PI陰性或弱陽性，壞死細胞則呈Annexin-V陰性或弱陽性、PI強陽性［3］。本研究應用Annexin V-FITC／PI法對細胞凋亡進行了檢測，結(jié)果顯示，0.1～10 g／L濃度的RGOs干預后可明顯減少細胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死，與形態(tài)學觀察的結(jié)果相符，進一步證明RGOs具有抗凋亡作用。

Caspase家族在介導細胞凋亡過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3是關鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導的多種途徑中發(fā)揮功能［4］。通常caspase-3以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活。因此，caspase-3常被用作早期細胞凋亡的指標?；罨腸aspase-3由兩個大亞基和兩個小亞基組成，可裂解相應的胞漿、胞核底物，最終導致細胞凋亡［5］。利用活化的caspase-3可以催化某些底物（Ac-DEVD-p NA、Ac-DEVD-AMC）的特性，通過檢測其催化產(chǎn)物的吸光度（p NA）或熒光強度（AMC）可以間接反映caspase-3活化的情況，從而可鑒定細胞凋亡的發(fā)生［6］。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2／SD可顯著增加ASCs caspase-3的活性，而給予不同濃度RGOs干預后，caspase-3的活性均有不同程度的下降，最佳作用濃度為0.1～1 g／L。進一步證實具有抗H2O2／SD引起的細胞凋亡作用。

地黃多糖具有補血、降血糖、抗腫瘤、增強免疫及保護心腦組織避免ATP耗竭和缺血損傷的作用。RGOs系從地黃多糖中進一步分離提取的有效成分，對于地黃及其組分抗氧化損傷的機制國內(nèi)外學者也進行了研究［7-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，RGOs可以減輕H2O2／SD所致ASCs的凋亡，表現(xiàn)在不同濃度RGOs處理后ASCs活性增加，細胞凋亡率下降，其作用機制可能與RGOs降低caspase-3活性有關，即RGOs可能通過抑制內(nèi)源性凋亡通路中的線粒體途徑來發(fā)揮抗凋亡作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同濃度RGOs抗ACSs凋亡的作用不同，其抗凋亡作用主要集中在0.1～1 g／L之間，而低濃度（0.01 g／L）及高濃度（10 g／L）組抗凋亡作用弱或引起凋亡加重，其原因可能與中藥的雙向調(diào)節(jié)作用有關。

（本文圖1見插圖5-1）

［1］ 裴志勇，趙玉生，高偉，等.過氧化氫.血清饑餓誘導脂肪組織來源干細胞凋亡模型的建立［J］.中國臨床保健雜志，2012，15（3）：264-267.

［2］ Chen GG，Sin FL，Leung BC，et al.Glioblastoma cells deficient in DNA-dependent protein kinase are resistant to cell death［J］.JCell Physiol，2005，203（1）：127-132.

［3］ Baxa DM，Luo X，Yoshimura FK.Genistein induces apoptosis in T lymphoma cells via mitochondrial damage［J］.Nutr Cancer，2005，51（1）：93-101.

［4］ Zhivotovsky B.Caspases：the enzymes of death［J］.Essays Biochem，2003，39（1）：25-40.

［5］ Philchenkov AA.Caspases as regulators of apoptosis and other cell functions［J］.Biochem istry（Mosc），2003，68（4）：365-376.

［6］Fischer U，Janicke RU，Schulze-Osthoff K.Many cuts to ruin：a comprehensive update of caspase substrates［J］.Cell Death Differ，2003，10（1）：76-100.

［7］ 樊淼，楊菁，白劍，等.地黃寡糖及其主要成分對大鼠腦片氧化應激損傷保護作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25（5）：64-67.

［8］ Yu HH，Kim YH，Jung SY，etal.Rehmannia glutinosa activates intracellular antioxidant enzyme systems inmouse auditory cells［J］.Am JChin Med，2006，34（6）：1083-1093.

［9］ Yu HH，Seo SJ，Kim YH，et al.Protective effect of Rehmannia glutinosa on the cisplatin-induced damage of HEIOCl auditory cells through scavenging free radicals［J］.I Ethnopharmacol，2006，107（3）：383-388.

［10］LiY，Bao Y，Jiang Bo，etal.Catalpol protects primary cultured astrocytes from in vitro ischemia-induced damage［J］.Int JDev Neurosci，2008，26（3／4）：309-317.

Effect of rehmannia glutinosa oligosaccharides on hydrogen peroxide combined serum deprivation-induced apoptosis in adipose tissue-derived stem cell

PEIZhiyong*，ZHAOYusheng，GAOWei，YIN Qiaoχiang（*Department of Geriatric Cardiology，Beijing Military General Hospital，Beijing 100700，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Rehmannia glutinosa oligosaccharides（RGOs）on hydrogen peroxide combined serum deprivation-induced apoptosis in adipose tissue-derived stem cells.M ethods An apoptosismodel ofminiswine adipose tissue-derived stem cells（ASCs）was established by hydrogen peroxide and serum deprivation（H2O2／SD）in vitro.RGOs（0.01 g／L，0.1 g／L，1 g／L，10 g／L）were pretreated for 12 hoursand incubated for6 hours.Apoptosis of ASCs was determined by Annexin V-FITC／PI apoptosis kit，and the cell varibility and Caspase-3 activity was detected by CCK-8 assay and caspase-3 assay kit，respectively.Resu lts RGOs significantly attenuated hydrogen peroxide combined serum deprivation-induced ASCs apoptosis，with a decreased apoptosis rate and caspase-3 activity，an increased cell varibility.Conclution RGOs has a protective effect on hydrogen peroxideand serum deprivation-induced apoptosis of adipose tissue-derived stem cells.

Stem Cell；Apoptosis；Hydrogen peroxide；Rehmannia；Swine

R329.25

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.05.025

2014-01-09）

國家高科技研究發(fā)展計劃（2006AA02A105）

裴志勇，博士，副主任醫(yī)師，Email：peizy6618222＠sina.com