牛黃清感膠囊對呼吸道合胞病毒體外預(yù)防作用的實(shí)驗(yàn)研究

周有財(cái) 常 洋 王玉瑩

(黑龍江澳利達(dá)奈德制藥有限公司，黑龍江 慶安 152400)

牛黃清感膠囊對呼吸道合胞病毒體外預(yù)防作用的實(shí)驗(yàn)研究

周有財(cái) 常 洋 王玉瑩

(黑龍江澳利達(dá)奈德制藥有限公司，黑龍江 慶安 152400)

檢測牛黃清感膠囊對呼吸道合胞病毒(RSV)的預(yù)防的作用，為抗病毒藥物的篩選、研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在VERO細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，采用病毒細(xì)胞形態(tài)變化CPE法、MTT染色法，檢測不同濃度的牛黃清感膠囊對呼吸道合胞病毒(RSV)的預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)分一次用藥組和三次用藥組，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度IC50，最小有效濃度MIC及治療指數(shù)TI。體外抑制和預(yù)防呼吸道合胞病毒的藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示“牛黃清感膠囊”具有抑制和預(yù)防呼吸道合胞病毒的作用。

牛黃清感膠囊；呼吸道合胞病毒；實(shí)驗(yàn)研究

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 驗(yàn)證藥物：牛黃清感膠囊，國藥準(zhǔn)字Z20026054，每粒含0.3 g生藥，批號091202，生產(chǎn)日期：2009.12.02，由黑龍江澳利達(dá)奈德制藥有限公司提供。

1.2 陽性藥物對照：利巴韋林注射液(病毒唑)，0.1克/支，蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字（1988）第347003號：批號000223，由蘇州第六制藥廠生產(chǎn)。

1.3 細(xì)胞：非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(VERO)第126-128代，由中國藥品生物制品鑒定所提供。

1.4 病毒：呼吸道合胞病毒(RSV)標(biāo)準(zhǔn)毒株Long，批號：19981212，由中國微生物菌毒種保藏管理中心提供。

1.5 生物安全二級實(shí)驗(yàn)室，由中國微生物菌毒種保藏管理中心提供。其他器材見表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

牛黃清感膠囊對呼吸道合胞病毒(RSV)的預(yù)防作用：

2.1 病毒CPE法：①細(xì)胞培養(yǎng)：VERO細(xì)胞P126-P129代，采用0.05%Trysin-EDTA消化，以40萬/毫升的濃度接種96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為L-谷氨酸完全型D-MEM、10%的進(jìn)口特級胎牛血清。37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)至細(xì)胞對數(shù)生長期最旺盛90%成片細(xì)胞，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，采用Hank's溶液洗細(xì)胞2次。②藥物作用細(xì)胞：牛黃清感膠囊，選用對細(xì)胞的最大無毒濃度（TD0）2倍稀釋8個濃度，即750～5.9 μg/mL，同時設(shè)利巴韋林注射液陽性藥物對照，2倍稀釋9個濃度1250～4.9 μg/mL，每濃度接種感染細(xì)胞3孔，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)分一次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的VERO細(xì)胞1次），三次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的VERO細(xì)胞，每24 h棄掉舊藥液，換同濃度的藥液，連續(xù)3次）。③病毒攻擊：將呼吸道合胞病毒(RSV)，采用病毒生長液（D-MEM培養(yǎng)基中含牛血清白蛋白組分12.5 mL、青酶素100 U/mL、鏈酶素100 μg/mL，HEPES12.5 mL）稀釋至40TCID50，接種經(jīng)藥物作用的VERO細(xì)胞96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，同時設(shè)病毒對照（40TCID50病毒液），設(shè)正常細(xì)胞對照。37 ℃、5% CO2孵箱中吸附2 h，棄掉病毒稀釋液，采用Hank's溶液洗2次。④細(xì)胞培養(yǎng)及觀察：每孔加入100 μL病毒生長液，37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，每24 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)CPE變化，以25%以下細(xì)胞形態(tài)CPE變化為“+”，26%～50%細(xì)胞形態(tài)CPE變化為“++”，51%～75%細(xì)胞形態(tài)CPE變化為“+++”，76%～100%細(xì)胞形態(tài)CPE變化為“++++”，至病毒對照出現(xiàn)“++++”時結(jié)束實(shí)驗(yàn)，用Reed-Muench法，計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度（IC50）和最小有效濃度（MIC）及治療指數(shù)（TI）判斷藥效。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 其他器材

表2 不同濃度“牛黃清感膠囊”體外預(yù)防呼吸道合胞病毒(RSV)藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 病毒MTT染色法：觀察細(xì)胞病變CPE結(jié)果后，加入MTT 5 mg/mL，每孔10 μL，置37 ℃培養(yǎng)4 h，然后加入100 μL DMSO有機(jī)溶劑，室溫20 min，充分溶解細(xì)胞（過程中稍加震蕩）。然后，采用酶標(biāo)儀波長570 nm測定，記錄OD值，計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度IC50和最小有效濃度MIC及治療指數(shù)TI，判斷藥效。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié) 果

牛黃清感膠囊體外預(yù)防呼吸道合胞病毒(RSV)藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在VERO細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，采用病毒細(xì)胞形態(tài)變化CPE法、MTT染色法，檢測不同濃度的牛黃清感膠囊對呼吸道合胞病毒(RSV)的預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)分一次用藥組和三次用藥組，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度IC50，最小有效濃度MIC及治療指數(shù)TI。三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

4 討 論

呼吸道合胞病毒是呼吸道感染常見的致病原因之一，患者的主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、喘息、氣促，病情嚴(yán)重時可出現(xiàn)嚴(yán)重的心力衰竭，甚至威脅生命安全[1]。臨床上6個月以內(nèi)嬰兒的毛細(xì)支氣管炎以及年幼兒RSV肺炎可威脅生命。除年齡外，其他高危因素如先天性心臟病伴有肺動脈高壓或慢性肺疾患、早產(chǎn)、早產(chǎn)伴支氣管肺發(fā)育不良均可增加RSV感染的嚴(yán)重度和病死率。另外，RSV感染引起的毛細(xì)支氣管炎與兒童反復(fù)喘息密切相關(guān)，也是兒童哮喘急性發(fā)作的重要誘因[2]。我們對呼吸道合胞病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明“牛黃清感膠囊”經(jīng)在非洲綠猴腎傳代細(xì)胞上，進(jìn)行呼吸道合胞病毒體外抑制和預(yù)防藥效實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同濃度的“牛黃清感膠囊”能夠抑制此病毒的繁殖。

[1] 豐力.更昔洛韋治療呼吸道合胞病毒肺炎的療效觀察[J].實(shí)用藥物與臨床,2012,l5(5):317-318.

[2] 朱秋皎,劉繼賢.呼吸道合胞病毒肺炎患兒TLR4及IFN-γ臨床觀察[J].天津醫(yī)藥,2012,40(7):738-739.

R282.720.7

B

1671-8194（2014）29-0068-02