消痹方對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨Cyclin D1 mRNA的影響

林喬齡李 民* 陳 志

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000；2 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003）

消痹方對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨Cyclin D1 mRNA的影響

林喬齡1李 民2* 陳 志1

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000；2 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003）

目的探討消痹方對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨Cyclin D1 mRNA的影響。方法將新西蘭大白兔分為試驗組和對照組，術(shù)后1周開始分組灌胃治療。采用X線攝片、光鏡對軟骨下骨進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，RT-PCR法檢測軟骨下骨Cyclin D1的表達(dá)。結(jié)果試驗組軟骨下骨退變表現(xiàn)、骨質(zhì)增生和軟骨下骨結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象明顯較對照組輕，試驗組骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)Cyclin D1 mRNA表達(dá)量較低（P＜0.05）。結(jié)論消痹方通過下調(diào)Cyclin D1 mRNA的表達(dá)，降低軟骨下骨重塑速率。

消痹方；骨性關(guān)節(jié)炎；Cyclin D1 mRNA

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物：消痹方由巴戟天、紫河車、杭白芍、青風(fēng)藤、兩面針、白術(shù)組成，系根據(jù)福建省名老中醫(yī)章寶春臨癥經(jīng)驗整理，現(xiàn)為漳州市中醫(yī)院協(xié)定方。

1.1.2 動物：健康6個月齡新西蘭大白兔64只，體質(zhì)量（2000±100）g，雌雄各半。

1.1.3 主要試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIZOL；PCR引物；CycleTESTTM Plus DNA Reagent Kit；FITC-conjugated Cyclin D1 Antibody Reagent set。

1.1.4 主要儀器：全自動石蠟切片機，萬能研究顯微鏡，紫外分光光度計，超純水裝置，CR系統(tǒng)，基因擴增儀，蛋白核酸分析儀，離心機，低溫冰箱，攤片烤片機，生物組織自動脫水機，，生物組織包埋機，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，紫外透射分析儀，凝膠成像系統(tǒng)，三恒多用電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 試驗前動物處理：①分組及造模：健康6個月齡新西蘭大白兔64只，隨機分為試驗組和對照組，每組各32只。兩組均行常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，根據(jù)改良Hulth法造模[1]：取兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶。術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素20萬單位，每日2次。②動物喂養(yǎng)：采用一籠一兔喂養(yǎng)，飼養(yǎng)期間觀察其毛色、食欲、活動和體質(zhì)量變化，術(shù)后1周開始每天驅(qū)趕2次，每次30 min。③給藥：按體表面積換算與人的給藥劑量[2]：新西蘭兔（2.0 kg）=成人（60 kg）每日藥量×0.07×2/3×2.0=1.12 g。試驗組給予消痹方水溶液10 mL/d（含消痹方1.12g）灌胃，每日1次；對照組給予生理鹽水10 mL/d灌胃，每日1次。④取材：兩組動物均于術(shù)后1、6、9、12周分批處死取材，每批每組各隨機抽取8只動物。

1.2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.2.1 X線片：攝兔雙膝正側(cè)位CR片，觀察兩側(cè)膝關(guān)節(jié)骨結(jié)構(gòu)，包括周圍軟組織、關(guān)節(jié)間隙、關(guān)節(jié)面的變化及有無骨贅形成。

1.2.2.2 光鏡制樣與觀察步驟：①取材：脛骨內(nèi)側(cè)髁中央的軟骨連同軟骨下骨，修成1 cm×1 cm×1 cm大小組織塊。②固定：10%福爾馬林溶液固定7 d。③沖洗：流水沖洗24 h。④脫鈣：10%EDTA二鈉鹽，溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液，以氫氧化鈉調(diào)至pH 7.0，脫鈣14 d。⑤沖洗：流水沖洗24 h。⑥脫水：70%酒精2 h→85%酒精2 h→90%酒精2 h→95%酒精2 h→100%酒精2 h。⑦透明：二甲苯浸泡30 min。⑧浸蠟、包埋：室溫25 ℃，石蠟58 ℃，浸蠟4 h中間換2次，常規(guī)石蠟包埋。⑨切片、染色：輪轉(zhuǎn)式切片機切5～6 μm的薄片→二甲苯15 min→二甲苯25 min→100%酒精3 min→95%酒精3 min→90%酒精3 min→85%酒精3 min→70%酒精3 min→蒸餾水浸洗2 min→蘇木素5 min→自來水洗去浮色→1%鹽酸酒精分色→自來水反藍(lán)20 min→70%酒精3 min→85%酒精3 min→二甲苯15 min→二甲苯23 min→中性樹膠封片。⑩光鏡下觀察：關(guān)節(jié)軟骨各層細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化、是否有群集，軟骨有無裂隙，細(xì)胞有無凋亡，軟骨下有無假性囊腫形成、骨質(zhì)增生、骨小梁骨折及軟骨下骨密度。

1.2.2.3 RT-PCR法檢測軟骨下骨相關(guān)指標(biāo)：①總核糖核酸（RNA）的提取：總RNA的提取嚴(yán)格依照TRIzol試劑操作說明進(jìn)行。取適量RNAlaterTM試劑保存的兔骨或軟骨組織，置入勻漿器中充分研磨，加入1 mL TRIzol再混合均勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL Ep管中，室溫靜置5 min；每管加氯仿200 μL，激烈混勻后靜置分層，在4 ℃ 12000 rpm的條件下離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至一新1.5 mL Ep管；加500 μL異丙醇室溫沉淀10 min，在4 ℃ 12000 rpm的條件下離心10 min；用75%乙醇（DEPC水配制）洗沉淀1次，然后風(fēng)干，溶于適量無RNA酶水中；每一RNA樣品取適量紫外分光光度計定量，其余-80 ℃保存待用。②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：吸光光度儀測定RNA的吸光度值（OD值），用于檢測RNA純度及其濃度。取80 μL DEPC水調(diào)零吸光光度儀，取1 μL待測RNA用DEPC水100倍稀釋，吸取80 μL稀釋后的RNA，測定260 nm和280 nm的OD值。當(dāng)260 nm OD值與280 nm OD值的比值在1.8～2.0，說明提取的RNA純度高。RNA的濃度=260 nm OD值×40 μg/mL×稀釋倍數(shù)，計算出RNA的濃度。20 μL體系反轉(zhuǎn)錄過程：RNA 1 μg（根據(jù)濃度計算出體積），加0.05 μg/μL Oligo（dT）18 primer 1 μL，再加DEPC水至12 μL，混勻，70 ℃的條件下離心5 min，立即冰水浴，離心。在冰上依次加入5×reaction buffer 4 μL、RibolockTM Ribonuclease Inhibitor 1 μL、10mM dNTP mix 2 μL，混勻，37 ℃條件下離心5 min之后加入RevertaidTM M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL。在42 ℃的條件下靜置60 min，再在72 ℃的條件下靜置10 min（破壞MLV），最后在4 ℃冰水浴的狀態(tài)下保存?zhèn)溆?。③c-fos擴增引物合成：c-fos引物：產(chǎn)物長度241bp；上游：5'-CGATTCGCCTACTTCC-3'；下游：5'-TCCGCTCCACTTCATT-3'。引物使用前用DEPC水溶解成10 pmol/μL濃度的引物溶液。PCR反應(yīng)（20 μL體系）：Taq Buffer 10（1.5 μL），dNTP（10 mM，0.2 μL），上游引物（10 pmol/μL，0.3 μL），下游引物（10 pmol/μL，0.3 μL），cDNA模板（1 μL），Taq酶（5 U/μL，0.2 μL），DEPC水（16.5 μL）→混勻，離心→95 ℃ 5 min，預(yù)變性→94 ℃ 30sec變性，80 ℃40sec退火，72 ℃30sec延伸，35循環(huán)→72 ℃ 7 min，終末延伸→4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物加入溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電流10 mA，電壓100 V，電泳時間60 min，電泳結(jié)果通過凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行PCR定量；樣本c-fos mRNA等產(chǎn)物的PCR定量與內(nèi)參β-actin的PCR定量比值，為該樣本mRNA在組織中的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：運用SPSS 18.0軟件包處理分析，參數(shù)值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用ONE-WAY ANOVA（單向方差分析）。

2 結(jié) 果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 造模12周X線片觀察結(jié)果。試驗組：內(nèi)側(cè)間隙狹窄不明顯，關(guān)節(jié)面粗糙變形，關(guān)節(jié)邊緣有輕微骨贅形成，軟骨下骨密度稍增高（圖1、2）。對照組：內(nèi)側(cè)間隙變窄，關(guān)節(jié)面粗糙變形，關(guān)節(jié)邊緣有明顯骨贅，脛骨內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面外側(cè)稍塌陷，軟骨下骨骨密度不均勻，硬化與疏松并見（圖3、4）。

圖2 試驗組：側(cè)位片

圖3 對照組：正位片

圖4 對照組：側(cè)位片

圖5 試驗組：術(shù)后6周骨小梁（HE×100）

圖6 試驗組：術(shù)后9周骨小梁（HE×100）

圖7 試驗組：術(shù)后12周骨小梁（HE×100）

圖8 對照組：術(shù)后6周骨小梁（HE×100）

圖9 對照組：術(shù)后9周骨小梁（HE×100）

圖10 對照組：術(shù)后12周骨小梁（HE×100）

2.1.2 軟骨下骨光鏡觀察結(jié)果。試驗組：造模后6周軟骨下輕度骨骨質(zhì)疏松，偶見骨小梁骨折（圖5）；造模后9周，軟骨下骨骨質(zhì)疏松與骨修復(fù)并見，骨結(jié)構(gòu)輕度紊亂，偶見橫向骨小梁（圖6）；造模后12周，軟骨下骨出現(xiàn)局部骨質(zhì)輕度硬化，骨結(jié)構(gòu)稍紊亂，少量骨贅形成（圖7）。對照組：造模后6周軟骨下骨骨質(zhì)疏松嚴(yán)重，可見較多骨小梁骨折（圖8）；造模后9周，軟骨下骨骨質(zhì)疏松與骨修復(fù)并見，骨結(jié)構(gòu)紊亂明顯，可見大量橫向骨小梁（圖9）；造模后12周，軟骨下骨骨質(zhì)局部硬化明顯，骨結(jié)構(gòu)紊亂加重，骨贅形成多（圖10）。

2.2 軟骨下骨Cyclin D1 mRNA的表達(dá)：RT-PCR檢測Cyclin D1 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示見圖11、表1。

表1 Cyclin D1 mRNA電泳條帶灰度值比較（INT/mm2）

圖11 Cyclin D1 mRNA電泳圖

2.2.1 各組組內(nèi)不同時期比較：對照組造模后1、6、9周，隨著時間的推移Cyclin D1 mRNA表達(dá)不斷增強，它們之間均有顯著性差異（P＜0.05）；9周和12周時比較，Cyclin D1 mRNA表達(dá)無顯著性差異。試驗組6、9、12周時相較1周時表達(dá)增高，均有顯著性差異（P＜0.05）。2.2.2 各組組間比較：試驗組造模后6、9和12周Cyclin D1 mRNA表達(dá)相較對照組較低，組間有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討 論

軟骨下骨重塑就是在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的作用下，經(jīng)歷舊骨不斷被吸收，新骨又不斷形成的過程。骨細(xì)胞的增殖速率越高，則軟骨下骨重塑越快，Cyclin D1是反應(yīng)軟骨下骨重塑速率的重要指標(biāo)。消痹方干預(yù)后軟骨下骨Cyclin D1 mRNA的表達(dá)量較低，顯著低于對照組，表明消痹方通過下調(diào)Cyclin D1 mRNA的表達(dá)以抑制軟骨下骨的重塑速率，并能有效降低軟骨下骨的高轉(zhuǎn)化率，在早期減少軟骨下骨骨吸收，中后期抑制軟骨下骨骨形成，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨退變，延緩骨性關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程。

[1] 劉獻(xiàn)祥,李西海,周江濤.改良Hulth造模法復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究.[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(12):1104-1108.

[2] 苗明三.實驗動物和動物實驗技術(shù)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社, 1997:143.

R684.3

B

1671-8194（2014）34-0059-03

福建省自然科學(xué)基金資助項目（編號2012J01433）；國家臨床重點專科建設(shè)項目資助；國家中醫(yī)藥管理局“十二五”重點專科建設(shè)項目資助

*通訊作者