滋腎育胎丸對滋養(yǎng)細胞凋亡的影響及其作用機制研究

張嵩卉，張?zhí)m珍，趙 赫，勾晨雨

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260;2.第四軍醫(yī)大學，陜西西安710032)

已知胎盤細胞過度凋亡和凋亡與增殖之間的平衡紊亂在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎兒生長受限(FGR)的發(fā)病機制中起決定性作用[1]。臨床常用的治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、FGR的藥物，如地屈孕酮、丹參等就有抗滋養(yǎng)細胞凋亡作用。使用滋腎育胎丸結(jié)合西藥治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病雖已取得明顯臨床效果，但其具體作用機制并未完全明了。既往研究提示，與滋腎育胎丸組方成分近似的安胎養(yǎng)血方劑可通過減少腎小管上皮細胞凋亡影響移植腎功能[2]，據(jù)此猜測滋腎育胎丸也可能通過調(diào)控滋養(yǎng)細胞凋亡發(fā)揮療效。本研究旨在研究藥物作用機制，為中成藥的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 一般資料 隨機選擇2012年10月—2013年2月在廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院因社會因素行剖宮產(chǎn)的健康單胎產(chǎn)婦20例，產(chǎn)婦年齡21～33歲，孕38～39周，無其他妊娠并發(fā)癥。

1.2 主要試劑來源 滋腎育胎丸粉劑由廣州白云山中一藥業(yè)有限公司提供。細胞培養(yǎng)所用的DMEM、血清、Ham.sF12、HEPES及胰酶購自Gibco，Percoll細胞分離液購自Phamacia，AnnexinV－FITC凋亡檢測試劑盒購于聯(lián)科生物。鼠抗人Fas單克隆抗體、鼠抗人 FasL單克隆抗體、內(nèi)參β－actin、抗 β－actin抗體和相應(yīng)的第二抗體均購自Santa Cruz。其余常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 滋腎育胎丸提取制備 按比例稱取藥材于500 mL三角瓶中，加15倍量95%乙醇，60℃條件下水浴振蕩提取2h，取出過濾。將濾渣二次浸提后過濾，合并2次所得濾液，減壓濃縮，干燥后即得滋腎育胎丸提取物粉末，約占滋腎育胎丸總質(zhì)量2.2%。

1.3.2 分離和培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞 原代滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)參考肖敏等[3]的報道，采取胰酶消化Percoll密度梯度分離法。取剖宮產(chǎn)術(shù)后無菌胎盤組織裁出絨毛組織，經(jīng)Hank’s液清洗3次，將絨毛組織剪碎后用0.25%胰蛋白酶及20 IU/mL DNaseⅠ膠原酶Ⅰ于37℃消化30 min。消化液經(jīng)100目金屬篩網(wǎng)過濾后1000 r/min離心10 min，DMEM重懸細胞。收集細胞懸液2mL加于Percoll分離液上層，以2500 r/min離心20 min，吸取中層細胞，置于DMEM/Ham.sF12(1∶1)(含20%胎牛血清，25 mmol/L HEPES和4 mmol/L谷氨酰胺)調(diào)整細胞濃度至1×109L－1，于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。4 h后Hank’s液清洗3次去除未貼壁細胞后將貼壁細胞分別置于正常環(huán)境、缺氧環(huán)境、缺氧+不同濃度滋腎育胎丸溶液(10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)環(huán)境下培養(yǎng)。缺氧環(huán)境培養(yǎng)箱提供p(O2)＜15 mmHg(1%～2%O2+5%CO2+93%N2，1 mmHg=0.133 kPa)，正常培養(yǎng)環(huán)境提供p(O2)100 mmHg(5%CO2+95%空氣)。細胞培養(yǎng)至72h。

1.3.3 流式細胞儀檢測滋養(yǎng)細胞凋亡率 將各組細胞分別用2.5 g/L胰蛋白酶消化，洗滌后用PBS調(diào)整細胞密度為1×109L－1，1000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清 ;加入1 mL 預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮;1000 r/min，4℃離心10 min，棄上清;重復(fù)后2個步驟后再將細胞重懸于200 μL Binding Buffer;加入10 μL Annexin V－FITC輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μL Binding Buffer(總反應(yīng)體積500 μL)以及5 μL PI，上機檢測，共測5次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 Western blot法檢測滋養(yǎng)細胞Fas/FasL蛋白表達量參照文獻[4]的方法在細胞培育24 h后收集蛋白。取50 μg蛋白上樣至100 mg/L SDS2聚丙烯酰胺凝膠，在恒壓80 V下電泳分離后，以恒壓120 V將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入封閉緩沖液室溫振蕩1 h，加入一抗(Fas抗體濃度為1∶500，F(xiàn)asL抗體濃度為1∶1000)，4℃孵育過夜，洗膜后加二抗(1∶500)，室溫孵育1 h，洗膜后顯色，曝光顯影定影。Fas及FasL表達強度以與β－actin的比值表示，即為目的蛋白表達量的半定量結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)輸入計算機，由SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，進行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果 將各組滋養(yǎng)層細胞用Annexin－V－FITC與PI雙染后，流式細胞術(shù)顯示培養(yǎng)24 h后細胞凋亡情況。其中正常組滋養(yǎng)細胞凋亡率為(4.8±1.4)%，低氧組滋養(yǎng)細胞凋亡率為(14.8±2.0)%，10 mg/L滋腎育胎丸+低氧組滋養(yǎng)為(12.2±1.8)%，50 mg/L滋腎育胎丸+低氧組為(11.8±1.1)%，100 mg/L 滋腎育胎丸 +低氧組為(8.4 ±1.1)%。獨立樣本t檢驗顯示，低氧組滋養(yǎng)細胞凋亡率高于正常組及中、高濃度滋腎育胎丸+低氧組(P均＜0.05)。低濃度滋腎育胎丸+低氧組細胞凋亡率高于正常組及中、高濃度滋腎育胎丸+低氧組(P均＜0.05)，但與低氧組比較無顯著性差異(P＞0.05)。中等濃度滋腎育胎丸+低氧組細胞凋亡率高于正常組及高濃度滋腎育胎丸+低氧組(P均＜0.05)。

2.2 Western blot法檢測結(jié)果 體外培養(yǎng)環(huán)境下，滋養(yǎng)細胞Fas、FasL蛋白均為陽性，且Fas蛋白表達量均略低于FasL蛋白的表達量。培養(yǎng)24 h后顯示低氧環(huán)境對Fas、FasL具有上調(diào)作用。而中、高濃度滋腎育胎丸組Fas、FasL表達明顯減少，見表1。

表1 各組滋養(yǎng)細胞Fas、FasL表達指數(shù)(±s)

表1 各組滋養(yǎng)細胞Fas、FasL表達指數(shù)(±s)

注:①與正常組比較，P ＜0.05;②與低氧組比較，P ＜0.05。

組別Fas FasL正常組0.544 ±0.2020.976 ±0.241低氧組 0.725 ±0.345① 3.452±0.472①10 mg/L滋腎育胎丸+低氧組 0.696±0.362① 3.173±0.336①50 mg/L滋腎育胎丸+低氧組 0.671±0.314①② 2.033±0.157①②100 mg/L滋腎育胎丸+低氧組 0.633±0.293①② 1.984±0.145①②

3 討論

3.1 利用物理缺氧制造的低氧環(huán)境可增加體外滋養(yǎng)細胞凋亡率 制造體外培養(yǎng)缺氧環(huán)境觀察細胞理化性狀改變逐漸成為深入研究滋養(yǎng)細胞特性的手段。國內(nèi)外已有研究選用早孕期滋養(yǎng)細胞為對象，得到的實驗結(jié)論可直接反映早孕期滋養(yǎng)細胞在缺氧條件下的病變特點，但無法證明妊娠中晚期滋養(yǎng)細胞在相同條件下是否有同樣表現(xiàn)。本實驗取足月妊娠滋養(yǎng)細胞進行正常條件及缺氧條件下的培養(yǎng)，結(jié)果顯示低氧環(huán)境可增加足月妊娠滋養(yǎng)細胞的凋亡率，驗證了以物理缺氧法體外模擬缺氧環(huán)境的可重復(fù)性。雖然控制和維持物理缺氧條件稍有困難，但物理缺氧無疑最接近真實生理缺氧狀態(tài)，而且同化學缺氧法相比，物理缺氧法更適合根據(jù)不同實驗要求調(diào)整缺氧時間及程度。在大多數(shù)實驗室低氧培養(yǎng)箱相對普及的條件下，物理缺氧法值得繼續(xù)在實驗中使用。缺氧可導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞凋亡在此前的研究中已得到證實，但與相同缺氧條件下的早孕期滋養(yǎng)細胞凋亡率(32.9±9.7)%相比[5]，本實驗中妊娠晚期滋養(yǎng)細胞的凋亡率(14.8±2.0)%偏低。這一結(jié)果間接提示，妊娠早期滋養(yǎng)細胞對缺氧環(huán)境較妊娠晚期可能更敏感。

3.2 滋腎育胎丸可抵抗缺氧造成的晚孕滋養(yǎng)細胞凋亡 本實驗結(jié)果顯示低濃度滋腎育胎丸組對低氧造成的細胞凋亡無抑制作用，而中、高濃度滋腎育胎丸組均對低氧造成的細胞凋亡有抑制作用，且高濃度組較低濃度組抑制作用更明顯。提示滋腎育胎丸所起的抑制凋亡作用與藥物濃度成正比，存在劑量依賴關(guān)系。滋腎育胎丸由黨參、續(xù)斷、白術(shù)、巴戟天、何首烏、杜仲、菟絲子、熟地黃等組成，是我國著名中醫(yī)學家羅元愷教授在傳統(tǒng)組方壽胎丸基礎(chǔ)上改良制定的經(jīng)驗方，是國家中藥保護品種，并已由廣州中一藥業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。在臨床廣泛應(yīng)用于脾腎兩虛、沖任不固的滑胎、月經(jīng)不調(diào)、不孕癥的治療[6]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為腎主生殖，在辨證上認為氣虛血瘀是導(dǎo)致滑胎、胎萎不長等病癥的主因。而現(xiàn)代醫(yī)學從細胞學、分子生物學角度的研究已充分證實缺氧可導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞過度凋亡，繼而影響胎盤血運。故應(yīng)從益氣活血、改善胎盤循環(huán)、提高滋養(yǎng)細胞外氧濃度方面著手治療以上疾病。滋腎育胎丸組方中的部分藥物成分，如菟絲子黃酮已被提出可能通過減少線粒體CytC的溢出，降低Caspase－3活性，從而降低衰老模型小鼠心肌細胞的凋亡率[7]，或可通過對抗雷公藤多苷所致雄性幼鼠睪丸組織Bcl－2蛋白表達減少和Bax蛋白表達增強而增強雄性幼鼠生育能力[8]。而桑寄生主成分為萹蓄甙、黃酮類化合物、齊墩果酸、槲皮素等，有促胚胎發(fā)育及抑制子宮收縮的作用。單一成分的藥效固然肯定，但縱觀國藥發(fā)展歷史，流傳久遠的方劑往往依各組分的藥理性能嚴格遵循君、臣、佐、使，陰陽協(xié)調(diào)的機制，依優(yōu)勢互補原則進行調(diào)配，療效也較單一組分更加確實和明顯。

3.3 滋腎育胎丸可通過Fas/FasL途徑影響滋養(yǎng)細胞凋亡Fas/FasL分屬于腫瘤壞死因子及其受體家族，介導(dǎo)經(jīng)典的細胞死亡受體通路。既往研究發(fā)現(xiàn)母胎界面的羊膜、絨毛膜、蛻膜層中均有Fas及FasL表達。正常妊娠時，來自胎兒的抗原成分可刺激母體T淋巴細胞大量表達Fas，而滋養(yǎng)細胞則通過表達一定量的FasL與T細胞表面的Fas結(jié)合誘導(dǎo)該T淋巴細胞凋亡從而獲得免疫逃逸。既往研究顯示病理妊娠時胎盤部位細胞凋亡較正常妊娠時明顯增加，而Fas/FasL的表達明顯減少[1，9]。此現(xiàn)象被解釋為由于滋養(yǎng)細胞對FasL表達下降導(dǎo)致母體對滋養(yǎng)細胞殺傷作用增強，并最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。而其他組織在缺氧/復(fù)氧過程中的研究顯示細胞凋亡增多時伴有Fas/FasL表達增加[10]。本研究結(jié)果顯示離體環(huán)境下滋養(yǎng)細胞在缺氧時Fas的表達量與正常環(huán)境下比較無明顯差異，而FasL則在缺氧條件下明顯升高，提示缺氧條件下滋養(yǎng)細胞凋亡與FasL活躍有關(guān)。本實驗中，隨滋腎育胎丸溶液濃度升高，缺氧條件下的滋養(yǎng)細胞表達FasL減少，與此同時滋養(yǎng)細胞凋亡率下降，提示滋腎育胎丸抑制滋養(yǎng)細胞凋亡的作用與促使滋養(yǎng)細胞減少對FasL表達有關(guān)。

3.4 對滋腎育胎丸治療FGR的預(yù)期 目前滋腎育胎丸在臨床中的應(yīng)用不包括對FGR等中晚孕期病癥的治療。對國內(nèi)外文獻的回顧性分析結(jié)果顯示，尚無針對FGR的特效治療方法和突破性治療進展。西醫(yī)治療FGR的主要手段是改善胎盤微循環(huán)及營養(yǎng)支持治療，但存在藥物作用單一及有較多禁忌證等缺點。在漫長的臨床實踐中，利用中醫(yī)藥治療FGR切實取得了一些經(jīng)驗，但總體而言，中藥的使用仍未擺脫小范圍、經(jīng)驗性用藥的簡單模式。對中藥具體作用機制的深入研究相對匱乏，缺乏藥理基礎(chǔ)。對FGR患者的胎盤研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞增殖減少，凋亡增加，細胞功能障礙[4]。本實驗選用妊娠晚期滋養(yǎng)細胞為研究對象，證實滋腎育胎丸對缺氧導(dǎo)致的妊娠晚期滋養(yǎng)細胞的異常凋亡有抑制作用。這一結(jié)果從藥物作用基礎(chǔ)層面解答臨床用藥的可行性，無疑為應(yīng)用滋腎育胎丸治療FGR提供了一個良好預(yù)期。根據(jù)中醫(yī)學“異病同治”的理論，本實驗對已在臨床成熟使用的滋腎育胎丸提出了更廣闊的應(yīng)用方向，希望在進一步的臨床用藥中得到更確實的療效驗證。

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